转录因子JunB调控肌细胞蛋白质合成机制的研究

发布时间：2018-04-13 18:31

本文选题：JunB + SUnSET　；参考：《华中农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：骨骼肌是猪身体最大的组织,其重量约占总体重的40-50%。由于猪在出生时,肌纤维的数目已经确定,因此猪出生后骨骼肌的生长主要取决于蛋白质沉积的增加。当蛋白质合成大于蛋白质降解时,骨骼肌表现为生长。研究表明,调控蛋白质合成与降解的信号通路并不完全独立,存在关键节点可以同时调控蛋白质合成与降解,因此靶定节点可以明确调控靶点,更加有效地调控肌肉的净沉积。研究表明转录因子Jun B作为节点可以促进蛋白质合成并抑制蛋白质降解,其中抑制蛋白质降解的机制已基本阐明,但是Jun B调控蛋白质合成并不通过经典的m TOR信号通路,具体的机制尚不清楚。m TOR信号通路作为调控蛋白质合成的核心通路,主要是通过调控真核起始因子(eukaryotic initiaton factors,e IFs)发挥作用,因此,本试验的目的是研究Jun B与蛋白质翻译起始和翻译延长的关系,在细胞和分子水平阐明转录因子Jun B调控蛋白质合成的机制。课题的研究内容由两部分组成,第一部分为建立试验方法,将SUn SET非放射性方法发展为一个不仅可以检测蛋白质合成速率也能够研究蛋白质翻译起始和延长的方法;第二部分为机制研究,运用SUn SET方法检测过表达和敲低Jun B后对蛋白质合成速率的影响,及对翻译起始、翻译延长、核糖体生成的影响,以阐明转录因子Jun B调控蛋白质合成的调控机理。第一部分内容,运用SUn SET非放射性方法研究蛋白质翻译及检测蛋白质合成速率。主要结果如下:1、确定用1μg/m L嘌呤霉素孵育C2C12肌管30min最佳。在0~5μg/m L的浓度范围,随着嘌呤霉素浓度的升高,相应的含嘌呤霉素的蛋白质增多,但是当嘌呤霉素浓度达到10μg/m L时含嘌呤霉素的蛋白质反而减少。2、SUn SET方法适用于检测翻译起始/翻译延长变化所引起的蛋白质合成速率的变化。用胰岛素和雷帕霉素处理C2C12肌管细胞后分别促进和减少了m TOR、S6K1蛋白磷酸化,表明翻译起始发生变化,相应SUn SET方法分别检测到蛋白质合成速率增加和减少;用羰基氰化氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone,CCCP)处理C2C12成肌细胞2min后,m TOR、S6K1、e IF2?蛋白磷酸化没有发生变化,只有e EF2蛋白磷酸化增多,表明翻译起始没有发生变化而翻译延长受到抑制,相应SUn SET方法分别检测到蛋白质合成速率减少;用氨基酸饥饿和PBS饥饿处理C2C12成肌细胞后,m TOR、S6K1、e IF2?、e EF2蛋白磷酸化都发生变化,表明翻译起始和翻译延长都发生变化,相应SUn SET方法检测到蛋白质合成速率变化一致。3、SUn SET方法适用于检测C2C12成肌细胞、C3H10T1/2间充质干细胞等不同特性的细胞蛋白质合成速率。C3H10T1/2细胞分别进行PBS饥饿、雷帕霉素处理、氨基酸饥饿、及氨基酸饥饿后加入氨基酸四种实验处理后,运用SUn SET方法检测蛋白质合成速率,结果与前面C2C12细胞中所得结果基本一致。第二部分内容,转录因子Jun B调控C2C12成肌细胞蛋白质合成机制的研究。主要结果如下:1、Jun B调控蛋白质合成。C2C12成肌细胞过表达Jun B会促进蛋白质合成,敲低Jun B会抑制蛋白质合成。2、Jun B不影响m TOR信号通路及e IF2?蛋白磷酸化,也不影响18S和28S核糖体r RNA生成,但是会影响e EF2蛋白磷酸化和e EF2激酶蛋白磷酸化,并影响myostatin-Smad信号通路。C2C12成肌细胞中过表达和敲低Jun B检测m TOR、S6K1蛋白磷酸化没有变化,e IF2?蛋白磷酸化也没有变化,18S和28S核糖体r RNA生成也没有变化,但是过表达Jun B检测到翻译延长关键蛋白e EF2蛋白的磷酸减少,e EF2上游激酶e EF2k(Ser359)磷酸化增多,敲低Jun B结果相反,变化情况与Jun B调控的蛋白合成变化情况一致。同样过表达Jun B检测到myostatin基因表达下调,Smad蛋白磷酸化减少,敲低Jun B结果相反。综上所述,本研究的结论是:1、验证了SUn SET非放射性方法可以准确检测蛋白质合成速率变化,并可用于研究蛋白质翻译起始和延长速率变化;2、myostatin-Smad信号通路通过抑制蛋白质翻译延长抑制蛋白质合成;3、Jun B调控蛋白质合成不依赖于m TOR信号通路,其作用机制:一方面通过调控e EF2激酶活性调控e EF2蛋白的的活性,调控翻译延长;另一方面通过调控myostatin-Smad信号通路,调控蛋白质合成速率。
[Abstract]:In this study , the mechanism of protein synthesis by Jun B was studied . The results showed that the mechanism of protein synthesis and protein synthesis was not completely independent . When C2C12 myoblasts were treated with carbonyl cyanide m - chlorophenylhydrazine ( CCCP ) for 2 min , the phosphorylation of m TOR , S6K1 , e IF2 ? protein did not change , but only the phosphorylation of e EF2 protein increased , indicating that translation initiation did not change and translation extension was inhibited , and the corresponding RSET method respectively detected the decrease of protein synthesis rate . After treatment of C2C12 myoblasts with amino acid starvation and PBS starvation , m TOR , S6K1 , e IF2 ? The results are as follows : 1 , Jun B does not influence the synthesis of protein synthesis . The results are as follows : 1 . Jun B does not influence the phosphorylation of protein synthesis . 2 . myostatin - Smad signaling pathway can inhibit protein synthesis by inhibiting protein translation ; 3 . Jun B control protein synthesis does not depend on the m TOR signal pathway , and the action mechanism of the myostatin - Smad signaling pathway is that the activity of the e EF2 protein is regulated by regulating the activity of e EF2 kinase , the translation is prolonged ; on the other hand , the synthesis rate of the protein is regulated by regulating the myostatin - Smad signaling pathway .

【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.2

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