兔出血症病毒单克隆抗体的制备及标准抗原、标准血清的研制

发布时间：2018-05-20 12:26

本文选题：RHDV + 单克隆抗体　；参考：《扬州大学》2017年硕士论文

【摘要】：兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是兔出血症病毒(RHDV)引起的一种急性、致死性、高度接触性传染病。主要发病于3月龄以上的成年兔,以引起呼吸系统出血,实质器官出血、肝脏肿大、淤血、坏死为特点。RHDV最早于1984年爆发于中国江苏无锡,之后蔓延全国以及全球多个国家和地区。本研究中利用杆状病毒表达系统和原核表达系统表达RHDV-VP60分别作为免疫抗原和筛选抗原,研制了 3株针对RHDV-VP60蛋白的单克隆抗体,并用这些单克隆单体建立了针对RHDV-VP60的双夹心ELISA方法;同时应用RHDV-WX84株感染非免疫成年兔,制备了 RHDV抗原和多抗血清,并对抗原和抗体进行了一系列的鉴定和标定,获得了相关标准抗原和标准血清,为RHDV的血凝和血凝抑制方法提供了有效的方法和材料。1、兔出血症病毒单克隆抗体的研制参考genbank中的RHDV WX84毒株VP60的序列(登录号:AF402614)设计针对VP60的特异性引物,利用PCR技术扩增本实验室保存的RHDV VP60质粒。将扩增产物连接pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-6P-1-VP60,测序正确后,转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,结果获得了大小约87KD的重组蛋白GST-VP60,利用GST亲和柱对重组蛋白GST-VP60进行纯化。SDS-PAGE和Western-Blot结果表明,纯化后的融合蛋白GST-VP60杂条带少且具有良好的抗原性。以重组杆状病毒pBlueBacHis2B-VP60感染后的sf9细胞作为免疫原,按照常规程序免疫6-8周龄Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合。利用上述重组蛋白GST-VP60包被ELISA板,进行间接酶联免疫吸附实验(iELISA)筛选阳性细胞株,最终获得了 3株针对RHDV-VP60蛋白单克隆抗体的阳性细胞株,分别命名为:RHDV-VP60-2H6、RHDV-VP60-4H8、RHDV-VP60-6H5。Western-Blot与间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明,所得三株单抗均能与RHDV WX84株天然病毒发生特异性反应。亚类鉴定结果显示RHDV-VP60-2H6株单抗为IgG1,RHDV-VP60-4H8 和 RHDV-VP60-6H5 株单抗为 IgG2a,轻链型均为 Kappa。利用亲和层系技术分别纯化了 3株单抗腹水,SDS-PAGE显示获得了高纯度的单克隆抗体,为今后建立RHDV检测方法提供了良好的生物试剂。2、兔出血症病毒双夹心ELISA检测方法的初步建立利用研究内容一已经获得的3株针对RHDV-VP60蛋白的单克隆抗体分别进行交叉配对实验,最终确定RHDV-VP60-2H6为捕捉抗体,RHDV-VP60-4H8E酶标抗体,建立了一种针对RHDV的双夹心ELISA检测方法,并对捕捉抗体和酶标抗体的工作浓度,待检样品和酶标抗体的最佳孵育时间,底物作用时间以及最低检测病毒量进行了优化,建立了兔出血症病毒双夹心ELISA检测方法,该方法的建立为临床检测RHDV奠定了基础。3、兔出血症病毒标准抗原及标准抗体的研制本研究将RHDV WX84株病毒皮下注射普通级非免疫成年兔,取病死兔肝脏进行研磨,离心取上清,经甲醛灭活后过滤、分装,冻干。对制备的抗原进行纯粹性、特异性鉴定以及血凝效价测定。结果显示该样本中含有RHDV抗原,不含有实验室中常见的能凝集人O型红细胞的NDV、AIV等病毒抗原;样本HA效价为210。对制备抗原冻干品进行了物理性状,计算装量差异系数(CV)检查,以及支原体检验、无菌检验、冻干前后血凝效价、稳定性、均一性以及长期保存等一系列特性的标定,最终研制出兔出血症病标准阳性抗原。将灭活的病毒皮下注射4只普通级非免疫成年兔,第7天任取一只,耳动脉无菌采血,分离血清,制备弱阳性血清,再用未灭活的病毒以滴鼻方式攻毒加强免疫2次,在第50天,心脏无菌采血,分离血清。制得的血清经过高岭土和50%的人O型红细胞处理,加入硫柳汞,分装冻干。血凝抑制实验结果显示,本研究制备获得的抗RHDV血清血凝抑制价为分别为25,28。利用HI实验、玻片凝集实验技术鉴定,证明该血清与实验室中常见的能凝集人O型红细胞的NDV、AIV无交叉反应性,与大肠杆菌,巴氏杆菌也无交叉反应性,仅与RHDV反应,特异性良好;检查冻干品物理性状,计算装量差异系数值(CV),并进行支原体检验、无菌检验、冻干前后血凝抑制效价、稳定性、均一性以及长期保存等一系列特性的标定,最终研制出兔出血症病标准强阳性血清和弱阳性血清。
[Abstract]:The recombinant protein GST - VP60 was prepared by using the recombinant protein GST - VP60 as immunogen , and then the recombinant protein GST - VP60 was purified by using the recombinant protein GST - VP60 . A double sandwich ELISA assay was established for the detection of rabbit hemorrhagic disease .
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.4

【参考文献】