犬干扰素α的克隆表达及其修饰产物的研究

发布时间：2018-06-11 22:39

  本文选题：犬干扰素α + 克隆表达　； 参考：《华东师范大学》2015年硕士论文

【摘要】：随着经济发展,犬类饲养量日益增多,但是犬病,特别是病毒病的发病率也在不断升高,常常导致犬的死亡,给人类造成精神和经济上的损失。干扰素是一类具有抗病毒活性的细胞因子,其中干扰素α的抗病毒作用广谱而强效,犬干扰素a (CaIFNa)在治疗多种犬类病毒病中有显著疗效,因此有良好的应用前景。但是传统的生产方法成本高、制备工艺复杂,导致CaIFNα价格昂贵。同时目前市场上的CaIFNα活性时间短,需要频繁注射、治疗周期长。因此成本低廉且长效的CaIFNα研发成为热点。目前国内外关于基因工程克隆CaIFNα的研究报道较多,但是利用基因工程表达纯化得到活性CaIFNα的完整报道不多,其中主要以大肠杆菌(E.coli)作为表达系统,且大部分CaIFNa以包涵体形式表达。包涵体需要变性复性,不仅增加纯化过程而且蛋白复性产率偏低,因此包涵体变复性技术至今仍是应用E.coli表达系统制备蛋白质的主要瓶颈问题之一,研究者通常希望获得可溶性的目的蛋白。本文以E.coli作为表达系统,选用不同的标签蛋白与CaIFNα融合表达,分别得到了包涵体形式和可溶性蛋白形式的融合蛋白,并对两者进行比较,为获得大量有活性的CaIFNα提供途径。两亲性聚合物做为纳米药物载体,包裹药物后能延长药物活性、提高药物靶向性,被广泛应用和研究,因此是得到长效CaIFNα的可能途径。聚谷氨酸(PGA)是由生物发酵的大分子,来源易得、生物可降解,目前有众多研究证明其是良好的药物载体。但是PGA具有很强的亲水性,单独在水中难以自组装,不能直接作为CaIFNα的载体。因此本文将疏水性的苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE)通过酰胺化反应连接到PGA的羧基上,将PGA改造成两亲性聚合物材料PGA-PAE。 PGA-PAE同时具有亲水区域和疏水区域,所以在水中能自组装形成内部疏水和外部亲水结构的稳定纳米颗粒(NP),在形成过程中能装载水相中的犬干扰素α,自组装成为犬干扰素α纳米颗粒(NP-CaIFNa).本文对制备得到的NP及NP-CaIFNα进行了表征、制备条件优化和性质研究。本文的研究结果主要包括以下两方面：1.CaIFNα的克隆表达纯化及活性测定将CaIFNα的基因序列按照E.coli密码子进行优化,随后构建三个表达载体,使CalFNα与不同标签蛋白(Trx-tag、GST-tag、Nus-tag)融合表达,分别得到融合蛋白Trx-CaIFNα、GST-CaIFNα及Nus-CaIFNα。其中Trx-CaIFNα的表达量最高,37℃时表达量占菌体蛋白的71.9%；而Nus-CaIFNα的可溶性最高,当诱导温度为25℃时100%可溶。对包涵体Trx-CaIFNα进行复性及纯化,对可溶性蛋白Nus-CaIFNα进行纯化。纯化后Trx-CaIFNα和Nus-CaIFNα两个蛋白的纯度均大于90%,得率分别为74.8%和6.5%。用犬肾细胞-疱疹性口炎病毒病(MDCK-VSV)体系测定Trx-CaIFNα和Nus-CalFNα的体外抗病毒活性,结果测得两者的活性分别为(2.14±2.79)×1014 U/mol和(1.87±0.92)×1012 U/mol。用肠激酶切除Trx-CaIFNa的标签蛋白,得到CaIFNa,得率为38%,其抗病毒活性为(1.87±0.76)×1015U/mol。本文通过Nus-tag和降低诱导温度使Nus-CaIFNa全部可溶,不需要变性复性,节约了纯化过程的时间和成本,该提高可溶性的方法值得借鉴；包涵体Trx-CaIFNa的表达量最高,高于其他两种融合蛋白Nus-CaIFNa和GST-CaIFNa,更远高于其他研究报道,且复性得率高达74.8%；融合蛋白仍然保留了CaIFNa的抗病毒活性。2. NP-CaIFNa的制备和性质研究用枯草芽孢杆菌DL发酵制备PGA,经过酒精沉淀和酸降解得到分子量为15-30kD的PGA。用碳化二亚胺作为催化剂,使PAE的氨基与PGA的羧基通过酰胺化反应连接,合成PGA-PAE材料。核磁共振结果表明材料中同时出现PGA和PAE的特征峰,表明材料的正确合成。将PGA-PAE材料与等体积纯水混匀,在水中自组装成纳米载体NP,透射电镜下可见NP为球状纳米颗粒,分散性良好,粒径分布均匀。当PGA-PAE的浓度为40mg/mL、PGA的降解时间为9min、 PGA与PAE的摩尔比(即PAE的投料比)为0.68时,NP粒径为132nm,PDI为0.114,zeta电势为40.7mV,浓度为1.77×1013 particles/mL,表明制备得到稳定的纳米载体NP。以活性较高的Trx-CaIFNα为例,研究NP-CaIFNα。将PGA-PAE材料与等体积Trx-CaIFNα溶液混匀,水相中自组装成NP-CaIFNα,电镜下可见NP-CaIFNα为纳米尺寸的颗粒状结构,分散性良好。在优化制备条件下,NP-CaIFNα粒径为165nm,PDI为0.157,zeta电势为42.1mV,浓度为7.29×1012 particles/mL。NP-CaIFNα的体外抗病毒活性为(0.44±3.59)×1014 U/mol,保留了Trx-CaIFNα活性的20%左右。Trx-CaIFNα的体外释放实验证明有血清存在时Trx-CaIFNα能缓慢释放,30d约释放80%Trx-CaIFNα,提示NP-CaIFNα在体内可能缓慢释放Trx-CaIFNα,延长抗病毒活性。同时NP-CaIFNα在PBS中不会释放Trx-CaIFNα,提示NP-CaIFNα在体外能保持稳定。综上所述,本文用基因工程技术纯化得到Nus-CaIFNa、Trx-CaIFNα两种融合蛋白。其中Nus-CaIFNα蛋白全部为可溶性表达,为CaIFNα的可溶性研究提供借鉴；包涵体Trx-CaIFNα的表达量最高,37℃时表达量约占菌体蛋白的71.9%；以上结果为大规模生产CaIFNα提供了两条途径。本文还制备合成了基于PGA的NP-CaIFNα,研究证明NP-CaIFNα具纳米尺寸,保留了Trx-CaIFNα体外抗病毒活性,并在有血清条件下缓慢释放Trx-CaIFNα,提示在体内可能具有长效抗病毒活性。本文首次将基于PGA的两亲性纳米药物载体应用到CaIFNα上,为长效CaIFNα的开发提供了新思路。
[Abstract]:In this paper , there are many researches on the expression of CaIFN伪 , which can prolong the activity of CaIFN伪 , which can prolong the activity of CaIFN伪 , and it can not only increase the activity of CaIFN伪 , but also can not be used as a carrier of CaIFN伪 . A stable nanoparticles ( NP ) with inner hydrophobic and outer hydrophilic structures can be formed by self - assembly of PGA - PAE in water . The results of this study include the following two aspects : 1 . Cloning and expression purification of CaIFN伪 and fusion expression of CaIFN伪 in E . coli codon . Three expression vectors are constructed . The expression of Trx - CaIFN伪 , GST - CaIFN伪 and Nus - CaIFN伪 is obtained .
In vitro antiviral activity of Trx - CaIFN伪 and Nus - CalFN - 伪 was determined by the purification of Trx - CaIFN伪 and Nus - CalFN . The results showed that the activity of Trx - CaIFN - 伪 and Nus - CalFN - 伪 was higher than 90 % . The results showed that the activity of Trx - CaIFN - 伪 and Nus - CalFN - 伪 was higher than 90 % . The results showed that the activity of Trx - CaIFN伪 and Nus - CalFN 伪 was ( 1 . 87 卤 0.76 ) 脳 10 15 U / mol .
The expression of Trx - CaIFNa was the highest , which was higher than that of other two fusion proteins Nus - CaIFNa and GST - CaIFNa , which were much higher than those of other studies , and the yield of Trx - CaIFNa was 74.8 % .
The fusion protein still retains the antiviral activity of CaIFNa . The preparation and properties of NP - CaIFN伪 were studied by using Bacillus subtilis DL fermentation to prepare PGA . The results showed that NP - CaIFN伪 could release Trx - CaIFN伪 in vitro . The results showed that NP - CaIFN伪 could release Trx - CaIFN伪 in vitro . The results showed that NP - CaIFN伪 could release Trx - CaIFN伪 in vitro . The results showed that NP - CaIFN伪 could release Trx - CaIFN伪 in vitro .
The expression of Trx - CaIFN伪 was the highest at 37 鈩，

本文编号：2006955