奶牛乳腺炎中成纤维细胞分泌的SDF-1对乳腺上皮细胞的作用及机制研究

发布时间：2018-06-18 20:31

本文选题：基质细胞衍生因子1 + 上皮细胞间质转化　；参考：《西北农林科技大学》2017年硕士论文

【摘要】：奶牛乳腺炎是由于奶牛机体代谢和生理状态改变、乳房损伤及接触传染性或环境性病原微生物等引起的乳腺炎症反应。大量的文献已经证实乳腺组织中的乳腺上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等组成了乳腺组织的细胞免疫系统,共同参与乳牛乳腺炎的免疫应答。成纤维细胞是乳腺组织中数量最多的基质细胞,但其在奶牛乳腺炎和乳腺炎迁延不愈导致乳腺纤维化中的作用及机制尚不明确。本研究通过对比从奶牛炎性乳腺组织中分离的成纤维细胞(inflammatoryfibroblasts,INFs)和从正常乳腺组织分离的成纤维细胞(normalfibroblasts,NFs)的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白和炎症相关因子的表达或分泌水平等基本生物学特性的差异,明确基质成纤维细胞是否参与在奶牛乳腺炎疾病过程中;并进一步研究了在INFs中表达明显上调的基质衍生因子1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)对奶牛乳腺上皮细胞生物学功能的影响及机制,进而探究成纤维细胞在乳腺炎以及乳腺纤维化发生发展过程中的作用,这一研究对奶牛乳腺炎及纤维化的防治具有重要的意义。本研究首先运用实时定量聚合酶链反应(qRCR)和蛋白印迹技术(Western blot)检测ECM蛋白Ⅰ型胶原蛋白(Collagen-1)、波形蛋白(Vimentin)及基质金属蛋白酶-1(MMP-1)基因水平和蛋白水平的表达;通过qRCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测了细胞因子和趋化因子IL-8、CXCL2和SDF-1的基因和蛋白水平的表达;通过细胞划痕实验检测两种成纤维细胞的迁移能力;利用代表大肠杆菌毒力成分的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和代表金黄色葡萄球菌毒力成分的脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)建立体外的诱导的成纤维细胞模型检测ECM相关蛋白,细胞因子和趋化因子的蛋白水平表达。通过以上从不同角度对INFs和NFs生物学特性的对比,明确成纤维细胞是否参与奶牛乳腺的炎症过程。然后,通过建立成纤维细胞和乳腺上皮细胞的体外间接共培养模式,研究INFs对乳腺上皮细胞形态变化及EMT(epithelial-mesenchymal transition)标志分子如α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和角蛋白(Cytokeratin)表达的影响;并进一步通过一系列分子生物学的方法研究了在INFs中高表达的SDF-1对乳腺上皮细胞的影响及分子机制。最后,通过建立SDF-1诱导的体外乳腺炎小鼠模型验证SDF-1的促炎性和促纤维化作用。结果显示,Collagen-1、Vimentin、MMP-1等ECM蛋白和IL-8、CXCL2和SDF-1等炎性相关因子在INFs、LPS以及LTA诱导的成纤维细胞中的表达或分泌水平均明显高于NFs,表明成纤维细胞参与在奶牛乳腺的炎症应答过程。体外共培养结果显示,INFs可诱导乳腺上皮细胞的形态从铺路石样转变为梭形,并促进EMT标志分子α-SMA和Cytokeratin的表达,表明在共培养条件下,INFs可诱导乳腺上皮细胞发生EMT。进一步的研究发现,LPS和LTA处理后的NFs,以及炎性乳腺组织中SDF-1的表达或分泌都高于正常对照组。外源性SDF-1通过激活NF-κB通路促进乳腺上皮细胞发生EMT,诱导炎症反应并抑制细胞增殖。此外,体内实验发现SDF-1在小鼠乳腺中能够诱发乳腺炎和轻微的纤维化,而SDF-1的特异性抑制剂可以减轻这一现象,结果表明INFs分泌SDF1介导其对乳腺上皮细EMT和炎性诱导过程。综上所述,本研究表明奶牛乳腺在炎症状态下,基质成纤维细胞通过分泌SDF-1促进乳腺上皮细胞EMT和炎症反应的发生,进而参与乳腺炎及其迁延所致乳腺纤维化。这一发现从新的角度初步阐明了炎性状态下的乳腺间质成纤维细胞对上皮细胞的作用,为进一步探究乳腺炎及乳腺纤维化的发生机制奠定了基础。
[Abstract]:In this study , the effects of matrix - derived factor - 1 ( SDF - 1 ) on the biological function of bovine mammary epithelial cells were investigated by means of quantitative polymerase chain reaction ( qRCR ) and Western blot . In vitro co - culture showed that the expression or secretion of SDF - 1 in mammary epithelial cells was higher than that of normal control group . The results showed that the expression or secretion of SDF - 1 in mammary epithelial cells was higher than that of normal control group .
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.23

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