解淀粉芽孢杆菌影响小鼠巨噬细胞极化及其抵抗沙门氏菌感染的机理研究

发布时间：2018-07-08 18:33

  本文选题：解淀粉芽孢杆菌 + 沙门氏菌　； 参考：《浙江大学》2017年博士论文

【摘要】：益生菌可调节动物肠道微生态平衡和免疫功能,从而改善动物生产性能。芽孢杆菌制剂因其较好的抗逆性而得到广泛应用。本课题组前期已筛选获得一株可显著促进仔猪生长和改善肠粘膜免疫功能的解淀粉芽孢杆菌SC06(BaSC06)。本论文研究了 BaSC06对小鼠抗沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium,ST)感染和肠道巨噬细胞极化的影响及机理,旨在探明BaSC06对体内巨噬细胞极化的调控及其与抗ST感染的相关性主要研究内容和结果如下:(一)饲喂BaSC06对小鼠抗ST感染能力和肠道巨噬细胞极化的影响雄性C57BL/6小鼠随机分为四组,分别为Control组,BaSC06组,ST组和BaSC06+ST组。Control组和ST组小鼠饲喂普通饲粮,BaSC06组和BaSC06+ST组小鼠饲喂含有BaSC06的饲粮,连续饲喂8周。然后ST组和BaSC06+ST组小鼠灌服ST,3天后处死取样。研究结果表明:(1)饲喂BaSC06显著缓解由ST引起的小鼠体重下降、盲肠萎缩、回盲肠和结肠粘膜损伤及肠道炎症;(2)饲喂BaSC06可显著降低ST在小鼠肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph node,MLN)和脾脏中的移位,ST感染前后,BaSC06对派伊尔结(Peyer's patches,PP)、MLN和脾脏中的CD4:CD8比值均无显著影响,表明BaSC06不能调节T细胞分化。饲喂BaSC06对小鼠血清细胞因子IL-1β、IL-4、、IL-12、IL-10和IL-13无显著影响,显著增加IFN-γ含量;但可显著降低由ST感染引起的促炎因子IL-1β和IL-12的增加,促进抑炎因子IL-10的表达。以上结果表明,饲喂BaSC06可有效降低ST感染引起的系统性损伤和炎症反应;(3)饲喂BaSC06可明显降低ST感染引起的盲肠巨噬细胞浸润,同时诱导盲肠巨噬细胞向M1型和M2型极化,显著增加ST感染小鼠MLN中M1和M2型巨噬细胞数量。以上结果提示,饲喂BaSC06可诱导肠道巨噬细胞向M1型和M2型极化,有效缓解ST引起的小鼠肠道和全身感染。(二)BaSC06对巨噬细胞极化的影响以BaSC06处理小鼠巨噬细胞系Raw264.7,结果发现:(1)BaSC06与巨噬细胞共培养6h后显著增强巨噬细胞的吞噬杀菌功能;(2)基因表达和Western Blot检测表明BaSC06促进巨噬细胞向M1型极化;(3)流式细胞术检测发现ST感染可促进巨噬细胞向M2型极化,BaSC06与ST共同作用24h后促进巨噬细胞M1型极化,抑制M2型极化。腹腔注射BaSC06(106CFU/只)或ST(105CFU/只),12h后麻醉处死小鼠并分离腹腔巨噬细胞进行流式细胞术分析,结果表明:(1)ST诱导腹腔巨噬细胞向M2型极化,抑制M1型极化。BaSC06可诱导腹腔巨噬细胞向M1型极化,对M2型极化无显著影响;(2)过继回输经BaSC06诱导的原代巨噬细胞显著降低了脾脏的ST载菌量。以上结果表明BaSC06通过诱导巨噬细胞M1型极化增强其对ST的杀菌活性。通过构建抗生素小鼠模型可排除肠道菌群对结果的干扰,直接验证BaSC06对肠道巨噬细胞的极化的影响。每只小鼠灌喂20mg链霉素后灌服ST和BaSC06。结果表明,与抗生素处理组相比,ST感染诱导肠道巨噬细胞向M2型极化,对M1型巨噬细胞无显著影响,BaSC06促进肠道巨噬细胞向M1型极化,抑制ST诱导的M2型极化。以上结果表明,ST感染诱导巨噬细胞向M2型极化,BaSC06可直接诱导巨噬细胞向M1型极化,逆转ST诱导的M2型极化,促进细胞和机体清除ST。(三)解淀粉芽孢杆菌BaSC06调节的肠道菌群对沙门氏菌感染及巨噬细胞极化的影响饲喂BaSC06同时诱导小鼠肠道内巨噬细胞向M1型和M2型极化,BaSC06可直接诱导巨噬细胞向M1型极化,鉴于益生菌可调节肠道菌群发挥其益生作用,故推测BaSC06可能通过调节肠道菌群促进巨噬细胞向M2型极化。小鼠肠道菌群的分析结果表明:(1)饲喂BaSC06对健康小鼠的肠道菌群多样性无显著影响,但BaSC06可显著缓解ST感染导致的菌群多样性的降低。ST感染可降低疣微菌门(Verruccomicrobia)的比例,增加拟杆菌门(Bacterodetes)的相对丰度;而饲喂BaSC06显著升高疣微菌门(Verrucomicrobia)的比例,降低拟杆菌门(Bacterodetes)的相对丰度,表明BaSC06可缓解ST引起的菌群失衡。将Control组和饲喂BaSC06组小鼠的粪便菌群移植给抗生素处理后的小鼠,检测盲肠炎症和巨噬细胞极化,结果表明:(1)移植BaSC06组小鼠的粪便菌群后能够缓解ST引起的盲肠中性粒细胞浸润,缓解盲肠炎症;(2)BaSC06组小鼠粪便菌群能够促进盲肠巨噬细胞向M2型极化。以上结果表明BaSC06可通过调节肠道菌群促进巨噬细胞向M2型极化,维持肠道稳态,缓解ST感染引起的炎症反应。综上所述,饲喂BaSC06可直接促进巨噬细胞M1型极化,增加其对ST的杀伤功能,同时BaSC06调节的肠道菌群能够促进巨噬细胞向M2型极化,维持肠道的微生态稳态和炎症平衡,饲喂BaSC06后诱导的肠道M1型和M2型巨噬细胞共同发挥抵抗ST感染的效果。
[Abstract]:Probiotics can regulate the intestinal microecological balance and immune function of animals, thus improving animal production performance. Bacillus spore preparation has been widely used for its good resistance to adversity. In our group, a strain of Bacillus starches SC06 (BaSC06), which could significantly promote the growth of piglets and improve intestinal mucosal immune function, was screened in our group. The effects and mechanisms of BaSC06 on Salmonella enterica serovar Typhimurium (ST) infection and intestinal macrophage polarization in mice were studied. The purpose of this study was to explore the main contents and results of the regulation of BaSC06 on the polarization of macrophages in vivo and its correlation with the anti ST infection. (1) the ability of feeding BaSC06 to resist ST infection in mice was fed. The male C57BL/6 mice were randomly divided into four groups: group Control, group BaSC06, group ST and BaSC06+ST group.Control and ST group of mice fed with common diet, BaSC06 and BaSC06+ST mice fed with BaSC06 diet and fed for 8 weeks. Then ST group and BaSC06+ST group mice were sacrificed in 3 days. The results were as follows: (1) feeding BaSC06 significantly alleviated the loss of weight in mice, cecum atrophy, cecum and colonic mucosa injury and intestinal inflammation caused by ST; (2) feeding BaSC06 significantly reduced the shift of ST in the mesenteric lymph nodes (Mesenteric, node, MLN) and the spleen in mice, and BaSC06 was the Peyer's P (Peyer's P) before and after ST infection. Atches, PP), the ratio of CD4:CD8 in MLN and spleen had no significant influence, indicating that BaSC06 did not regulate the differentiation of T cells. Feeding BaSC06 had no significant effect on the serum cytokines of IL-1 beta, IL-4, IL-12, IL-10 and IL-13. The above results show that BaSC06 can effectively reduce the systemic damage and inflammatory response caused by ST infection. (3) feeding BaSC06 can significantly reduce the infiltration of cecum macrophage caused by ST infection, and induce the cecum macrophage to M1 and M2 polarization, significantly increasing the number of M1 and M2 macrophages in ST infected mice MLN. The results suggested that feeding BaSC06 could induce M1 and M2 type polarization of intestinal macrophages, effectively alleviating intestinal and systemic infection in mice caused by ST. (two) the effect of BaSC06 on the polarization of macrophages was treated with BaSC06 to treat the mouse macrophage system Raw264.7. The results were as follows: (1) BaSC06 and macrophage co culture 6h significantly enhanced macrophage. Phagocytosis and bactericidal function; (2) gene expression and Western Blot detection showed that BaSC06 promoted macrophage to M1 polarization; (3) flow cytometry detected that ST infection could promote M2 type polarization of macrophages. BaSC06 and ST promote M1 polarization of macrophages and inhibit M2 polarization. Only after 12h anesthesia, the mice were killed and the peritoneal macrophages were isolated and analyzed by flow cytometry. The results showed: (1) ST induced M2 polarization in peritoneal macrophages, and M1 polarization.BaSC06 could induce M1 polarization in peritoneal macrophages, and there was no significant effect on M2 polarization; (2) the primary macrophage induced by adoptive return transfusion was significantly reduced. The results showed that BaSC06 could enhance its bactericidal activity to ST by inducing M1 polarization of macrophages. By constructing an antibiotic mouse model, the effects of intestinal flora on the results were excluded, and the effect of BaSC06 on the polarization of intestinal macrophages was directly verified. Each mouse was fed with 20mg streptomycin and filled with ST and BaSC06. after perfusion of streptomycin. The results showed that compared with the antibiotic treatment group, ST infection induced M2 polarization in the intestinal macrophages and had no significant effect on M1 type macrophages. BaSC06 promoted the M1 polarization of intestinal macrophages and inhibited the M2 polarization induced by ST. The results showed that ST infection induced macrophage to M2 polarization, and BaSC06 can directly induce macrophage to M1 type. Polarization, reversing ST induced M2 polarization, promoting cell and organism clearance of ST. (three) solution of Bacillus amyloid BaSC06 regulating the effect of intestinal microflora on Salmonella infection and macrophage polarization, feeding BaSC06 and inducing macrophage to M1 and M2 polarization in the intestinal tract of mice, and BaSC06 can directly induce macrophage to M1 polarization. Probiotics can regulate intestinal flora to play its probiotic effect, so it is presumed that BaSC06 may promote M2 polarization by regulating intestinal microflora. The analysis of intestinal microflora in mice showed that: (1) feeding BaSC06 had no significant effect on the diversity of intestinal flora in healthy mice, but BaSC06 could significantly alleviate the diversity of bacterial flora caused by ST infection. The reduction of.ST infection could reduce the proportion of Verruccomicrobia and increase the relative abundance of Bacterodetes, while feeding BaSC06 significantly increased the proportion of verruca microphylum (Verrucomicrobia) and reduced the relative abundance of the bacteribacillus gate (Bacterodetes), and indicated that BaSC06 could alleviate the imbalance of the bacterial flora caused by ST. Control group and BaSC06 were fed to BaSC06. The fecal flora of the mice was transplanted to the mice treated with antibiotics to detect the cecum inflammation and macrophage polarization. The results were as follows: (1) the fecal flora of the BaSC06 group can relieve the infiltration of the cecum neutrophils caused by ST and alleviate the cecum inflammation; (2) the fecal flora of group BaSC06 can promote the cecum macrophage to M2 type. The above results show that BaSC06 can promote M2 polarization by regulating intestinal microflora, maintain intestinal homeostasis and alleviate the inflammatory response caused by ST infection. In summary, feeding BaSC06 can directly promote M1 polarization of macrophages and increase the killing function of macrophages on ST, while BaSC06 regulated intestinal flora can promote macrophage to M2 Type polarization, maintain the balance of intestinal microecology and inflammation, and induce intestinal type M1 and M2 macrophages to resist ST infection after feeding BaSC06.
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S816

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本文编号：2108329