穿心莲内酯调控鸡致病性大肠杆菌群体感应系统的机制研究

发布时间：2018-10-18 11:21

【摘要】：鸡大肠杆菌病是由鸡致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）引起的一种局部或全身性疾病，一年四季均可爆发，可导致败血症、气囊炎、输卵管炎、蜂窝织炎等多种症状。APEC含有171个血清型，其中O78是亚洲最常见血清型之一。APEC含有许多毒力因子，包括摄铁螯合蛋白D（IucD），铁调节蛋白2（Irp-2），1型菌毛A（FimA），1型菌毛C（FimC），P型菌毛C（PapC），温度敏感血凝素(Tsh)，溶血素E（HlyE），血清存活因子（Iss），外膜蛋白A（OmpA）以及自转运空泡毒素（Vat）等。这些毒力因子与细菌铁摄取、代谢、黏附和侵入以及血清生存有关，而且这些毒力因子的表达可能与群体感应（Quorum sensing，QS）的调控密切相关。APEC感染开始于上呼吸道，通过破坏气-血屏障进入血液循环而到达全身，最终导致败血症的产生。其中鸡肺II型上皮细胞在维持气-血屏障功能方面具有重要的作用，是APEC突破气-血屏障的关键环节。穿心莲内酯（Andrographolide）是穿心莲的主要活性成分之一，具有抗炎、抗菌和抗病毒活性。此外，穿心莲内酯对绿脓杆菌QS系统具有抑制活性。因此，本研究我们主要探讨在鸡致病性大肠杆菌O78（APEC-O78）造成鸡肺II型上皮细胞损伤过程中，QS系统的自诱导信号分子2（autoinducer-2，AI-2）所发挥的作用；并初步分析穿心莲内酯是否能够通过干扰APEC-O78的QS系统抑制APEC-O78对鸡肺II型上皮细胞的损伤作用。首先，通过收集APEC-O78上清，并与的哈维弧菌BB170（Vibrio harveyiBB170，V. harveyi BB170）共培养，检测V. harveyi BB170发光间接检测AI-2的含量。结果发现，鸡致病性大肠杆菌APEC-O78具有分泌AI-2的能力，发光量与接种的APEC-O78上清量及共培养时间具有正相关性。APEC-O78分泌AI-2的量随其生长曲线发生改变，对数期AI-2分泌迅速上升，对数末期达到最大，但进入平台期后，AI-2分泌量迅速下降，直至衰亡期。在鸡致病性大肠杆菌黏附鸡肺II型上皮细胞的模型基础上，我们采用乳酸脱氢酶活性（Lactate dehydrogenase，LDH）检测法、台盼蓝拒染实验、涂板法、RT-PCR法等，研究APEC-O78能造成鸡肺II型上皮细胞损伤过程中，QS系统的AI-2所发挥的作用。结果发现，APEC-O78（107-109CFU/mL）均能诱导鸡肺II型上皮细胞损伤，且与接种107和109CFU/mL APEC-O78组相比较，108CFU/mL组APEC-O78能造成鸡肺II型上皮细胞更严重的损伤。细胞毒性实验和台盼蓝拒染实验结果表明APEC-O78引起的细胞损伤具有细菌密度依赖性。随后的RT-PCR研究结果也表明，与接种108CFU/mLAPEC-O78相比较，107CFU/mL APEC-O78组和109CFU/mL APEC-O78组中APEC-O78毒力基因分泌显著降低。以上结果表明APEC-O78诱导鸡肺II型上皮细胞形态学损伤及细胞死亡率，LDH释放，APEC-O78毒力基因mRNA的表达均与AI-2的释放量呈正相关性。为了分析穿心莲内酯能否通过干扰APEC-O78的QS系统抑制APEC-O78对鸡肺II型上皮细胞的损伤作用，我们采用电镜、激光共聚焦等方法进行了检测。结果表明，低于最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的穿心莲内酯能够显著降低APEC-O78诱导鸡肺II型上皮细胞LDH释放（P0.05），，F-actin骨架重排，显著降低APEC对鸡肺II型上皮细胞的粘附率（P0.05）。我们还发现，穿心莲内酯（10μg/mL）能显著降低APEC-O78AI-2的分泌（P0.05）。此外，鸡肺II型上皮细胞形态学损伤、细胞超微结构损伤，细胞死亡率，APEC-O78毒力基因mRNA的表达均与穿心莲内酯（10μg/mL）抑制APEC-O78AI-2释放的结果一致。综上所述，AI-2作为APEC-O78的QS关键调节因子，在APEC-O78诱导鸡肺II型上皮细胞损害过程中发挥着重要作用。而穿心莲内酯可能够作为APEC-O78的一种群体感应抑制剂（Quorum sensing inhibitor，QSI），降低APEC-O78AI-2分泌，且其降低APEC-O78诱导的鸡肺II型上皮细胞形态学损伤、细胞超微结构损伤等与抑制AI-2的释放结果一致。这为今后研究穿心莲内酯治疗鸡大肠杆菌病提供了分子生物学基础。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61

【参考文献】