猪瘟病毒NS5B蛋白与猪免疫应答因子TRIF、MyD88和MAVS的多克隆抗体制备及其相互作用初探

发布时间：2018-11-14 13:03

【摘要】：猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起猪的一种急性或慢性、热性和高度接触性传染病。猪瘟病毒NS5B蛋白是非结构蛋白,具有RNA依赖的RNA多聚酶活性,能与3'端非翻译区结合,负责病毒基因组的转录和复制。因此,制备猪瘟病毒NS5B蛋白多克隆抗体对进一步研究猪瘟病毒NS5B蛋白与宿主免疫应答因子的相互作用具有重要意义。猪瘟病毒在感染宿主过程中会抑制Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)的产生,逃逸宿主的免疫应答,导致持续性感染。IFN-Ⅰ的产生受Toll样受体(TLR)信号通路和视黄酸诱导基因Ⅰ受体(RLR)信号通路调控。在TLR信号通路中,主要通过接头分子p干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)和髓样分化因子(MyD88)接收上游受体分子信号,将其传递给下游相关分子从而引起一系列级联反应。在RLR信号通路中,通过接头分子线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)激活下游分子的转录和表达。目前生物制品市场上尚无这些抗体商品,没有这些抗体就难以对猪瘟病毒与宿主的相互作用机制进行深入研究。因此,制备TRIF、MyD88和MAVS的多克隆抗体将为进一步研究猪瘟病毒感染后宿主TLR和RLR信号通路的调控机制或猪瘟病毒的免疫逃避机制打下良好基础。本研究通过RT-PCR扩增并克隆了CSFV NS5B基因片段、猪TRIF、 MyD88和MAVS基因ORF的部分序列,构建了CSFV NS5B基因片段及TRIF、MyD88和MAVS基因的原核表达载体,转化表达菌Rosetta (DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达重组蛋白,采用Ni-NTA亲和层析等方法进行纯化,纯化的蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,通过蛋白免疫印迹(Western Blot)和间接免疫荧光试验(IFA)验证所制备多克隆抗体的反应性和特异性。本研究制备的多克隆抗体不仅与原核表达的重组蛋白发生反应,也与感染了CSFV的PK-15细胞表达的蛋白具有较高的特异性。用Western Blot检测抗CSFV NS5B多克隆抗体与原核表达的NS5B重组蛋白反应的稀释度可达1：8000,其他三个抗体与相应原核表达的重组蛋白反应稀释度可达1：16000。用构建的pcDNA3.0-NS5BFL真核表达质粒转染PK-15细胞,通过Western Blot和IFA均检测到了瞬时表达的NS5B蛋白,IFA检测的最佳工作浓度为1：200。CSFV感染PK-15细胞后Western Blot检测多抗的特异性,抗CSFV NS5B、TRIF、MyD88和MAVS多克隆抗体的最佳工作浓度分别为1：2000、1：1000、1：500和1：1000。本研究通过实时定量PCR技术(qPCR)和Western Blot技术对感染1.0MOI CSFV后PK-15细胞中免疫应答因子TRIF、MyD88和MAVS的mRNA和蛋白水平进行了检测。综合上述实验,本研究发现TRIF mRNA在感染猪瘟病毒后上调不显著,其蛋白水平也未呈现明显上调趋势；MAVS和MyD88mRNA分别在感染猪瘟病毒12和24 h后显著上调,其蛋白变化水平与mRNA水平一致。由此推测猪瘟病毒感染PK-15细胞后激活TLR信号通路和RLR信号通路,其中,激活的TLR信号通路主要为MyD88依赖的信号转导途径。
[Abstract]:Swine fever is an acute or chronic, feverish and highly contagious disease caused by swine fever virus (CSFV). The NS5B protein of classical swine fever virus (CSFV) is a non-structural protein with the activity of RNA dependent RNA polymerase and can bind to 3 '-terminal untranslated region, which is responsible for the transcription and replication of the virus genome. Therefore, the preparation of polyclonal antibodies against CSFV NS5B protein is of great significance to further study the interaction between CSFV NS5B protein and host immune response factors. Swine fever virus (CSFV) inhibits the production of interferon type I (IFN- 鈪，

本文编号：2331230