中国荷斯坦种公牛FAK基因调控区的遗传变异鉴定及其与精液品质的关联分析

发布时间：2018-11-20 09:28

【摘要】：在现代奶牛群体改良中，，种公牛是影响奶牛群体遗传品质的主要因素，其对奶牛群体遗传进展的贡献率高达70%以上。精液品质性状是种公牛选育工作中最基本的一项衡量指标，受到多基因控制，而常规育种手段选育良种公牛效率低，因此结合分子生物学技术，筛选出影响种公牛精液品质的候选基因作为分子标记，通过分子标记辅助选择育种，为未来定向选育高品质精液的种公牛提供参考。粘着斑激酶(Focal adhesion kinase, FAK)是一类胞质非受体蛋白酪氨酸激酶（PTKs），它在细胞信号转导中发挥重要作用，它是胞内外信号出入的中枢，介导多条信号通路。FAK还参与精子的释放和精子的获能等过程，在机体睾丸中具有较高的表达量，据此推测FAK基因可能是影响种公牛精液品质的一个候选基因。因此本课题以218头中国荷斯坦种公牛精液为样本，通过PCR和DNA测序技术筛选FAK基因的5'侧翼区和3'UTR区中的突变位点，运用SAS软件统计分析这些突变位点与公牛精液品质的关系，通过实验最终鉴定出功能性的突变位点。 1、中国荷斯坦公牛FAK基因3'UTR SNP的鉴定及其与精液品质的关联性分析本实验通过PCR和DNA测序技术对FAK基因的3'UTR区进行了SNPs位点的扫描，发现了1个SNP，即g.129462_129463insGAA。对该g.129462_129463insgaa SNP位点与种公牛精液品质关联分析发现，野生基因型BB种公牛个体的射精量和鲜精密度显著高于AA基因型种公牛。 2、3'UTR SNP g.129462_129463insGAA对bta-miR-21调控FAK基因表达的影响利用miRNA在线软件预测与FAK基因3'UTR区域结合的miRNAs。结果表明FAK基因3'UTR上的突变位点g.129462_129463insGAA位于bta-miR-21的种子序列区，而且发现此SNP突变前后影响FAK基因和bta-miR-21的结合能力。为了更好的验证分子标记g.129462_129463insGAA对bta-miR-21与FAK基因3'UTR片段结合能力的影响，利用细胞瞬时转染实验对上述预测结果进行了验证。分别将含有突变型和野生型两种基因型的FAK基因3'UTR片段连入pMIR-ReportTM Luciferase报告载体中，与bta-miR-21真核表达载体共转染MLTC-1细胞，通过双荧光素报告系统检测发现，与pMIR-REPORTLuciferase-FAK野生型重组质粒相比， bta-miR-21质粒与pMIR-REPORTLuciferase-FAK突变后的重组质粒共转染可使细胞的荧光素酶活性下降。通过Q-PCR检测g.129462_129463insGAA位点不同基因型个体中FAK mRNA的含量，结果发现，BB基因型个体中FAK mRNA的含量极显著（P0.01）高于AB基因型。上述的关联分析也表明，BB基因型个体的射精量和鲜精密度显著高于AA型种公牛，因此我们推测此SNP可能通过影响bta-miR-21与FAK基因3'UTR的结合能力，影响FAK基因的表达量，从而影响精子的释放。 3、中国荷斯坦公牛FAK基因的启动子区SNP与精液品质的关联性分析启动子作为基因必不可少的元件，可以影响基因转录的启动和表达的强度。本研究利用生物信息学方法预测FAK基因的启动子区，发现启动子区一些序列可与各种转录因子结合，包括NFATC1，STAT1，STAT3，FOXP1，SOX18，SP1等，这些位点的存在可能涉及FAK基因的转录调控机制。设计引物扩增该预测的启动子区，测序发现在该预测启动子区的靠近起始密码子处发现一个g.-58CT突变。通过测序分型及关联分析发现，该SNPs位点中，对种公牛个体的鲜精活力来说，CC基因型个体值显著低于TT基因型个体值（P＜0.05）。
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【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S823

【参考文献】