碱性植酸酶的定向进化及其在不同宿主中的表达

发布时间：2018-12-06 17:08

【摘要】：植酸酶能水解植酸及植酸盐,被广泛应用于饲料添加剂。碱性植酸酶具有较高的热稳定性、底物特异性及抗蛋白酶降解能力,不仅能够满足工业化生产要求,而且能适应动物肠道环境,是一种理想的饲料添加剂。但是,相对酸性植酸酶而言,碱性植酸酶最大的缺点是酶活较低,且在酸性环境中酶活受到严重抑制。因此,本研究首先通过定向进化的方法提高碱性植酸酶在酸性及中性条件下的酶活；然后通过比较正向突变体在三种不同宿主茵(大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌)中的定向进化规律及酶学性质,从而获得具有工业化应用潜力的重组菌株。通过分子克隆的手段从枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)中获得一个碱性植酸酶,并在大肠杆菌BL21中实现其异源表达。通过比较不同的表达方式,最终确定了用于下一步定向进化的重组菌构建和诱导条件,即以pET30a为表达载体、酶切位点为BglⅡ和XhoⅠ、去除植酸酶基因中的信号肽序列、诱导表达温度为25℃。然后以野生型碱性植酸酶基因为模板、以大肠杆菌BL21为表达宿主,通过两轮的定向进化、组合突变及饱和突变,获得了D24G、D24G/K70R/K111E/N121S、 D24G/K265N等正向突变体。在37℃、pH 7.0反应条件下,上述三株突变体的酶活比野生型分别提高了40.35%、52.06%、55.22%；在37℃、pH 4.5反应条件下,则分别提高了76.61%、121.05%、84.21%。本研究考察了上述三种突变体的酶学性质,包括最适pH、最适温度、pH稳定性、温度稳定性及动力学参数,结果显示突变体和野生型具有相同的最适反应温度、最适反应pH及pH稳定性,但三种突变体的温度稳定性均高于野生型；37℃、pH 7.0反应条件下的总催化效率(Keat/Km)依次为野生型的2.32、2.31、2.10倍；而37℃、pH 4.5反应条件下则分别是1.98、2.63、2.15倍。最后将酶活差距较大的突变体D24G、S51A、K265E、S51A/K265E、 D24G/K70R/K111E/N121S及野生型在毕赤酵母GS115和枯草芽孢杆菌WB800N中实现分泌性表达。通过比较该碱性植酸酶的不同突变体在三种表达体系中的催化特性与酶学性质,发现三种表达体系的定向进化规律基本一致,在大肠杆菌中表达时酶活高的突变体在毕赤酵母GS115和枯草芽孢杆菌WB800N中一般也相应较高。与大肠杆菌相比,在毕赤酵母中表达的野生型和突变体的酶活及最适反应温度均有所降低,D24G的最适反应温度从60℃降到55℃,而S51A则从60℃降到50℃,推测是由毕赤酵母中的糖基化现象引起。可能由于本研究中的碱性植酸酶基因来源于枯草芽孢杆菌,在枯草芽孢杆菌WB800N中表达时,突变体及野生型的酶活均有一定幅度的增加,37℃、pH 7.0反应条件下,枯草芽孢杆菌表达的突变体D24G酶活比在大肠杆菌中表达时提高了68.32%；而且D24G的最适反应温度从60℃上升到65℃。综上所述,枯草芽孢杆菌更适合用于此碱性植酸酶突变体的表达及工业化生产。本文通过定向进化方法得到了在酸性及中性条件下酶活提高的突变株,并通过三种表达体系之间的比较,确定了最优的碱性植酸酶表达宿主菌,为进一步探索和提高碱性植酸酶酶活使其更适用于工业化生产奠定了一定的基础。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S816.7;Q814.9

【参考文献】