大豆凝集素对整联蛋白介导的猪肠上皮细胞增殖与凋亡机制的研究

发布时间：2019-01-07 22:03

【摘要】：大豆凝集素(SBA)是大豆及大豆产品中含有的抗营养物质,这种物质可通过与肠道上皮细胞膜表面特异性结合,改变细胞的结构及功能,影响肠上皮细胞的代谢过程。整联蛋白是细胞膜上的跨膜糖蛋白,其介导的细胞粘附作用是指导细胞生物学功能的一个重要因素。为了阐明SBA在影响猪肠道上皮细胞健康过程中是否与整联蛋白的信号传递存在关系,本论文主要开展了以下三部分试验研究。本研究以仔猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为细胞模型,探究表达于IPEC-J2细胞中整联蛋白亚基的种类,探索这些整联蛋白亚基的在IPEC-J2细胞增殖,周期,凋亡以及SBA引起的IPEC-J2细胞周期及凋亡改变中的作用,初步研究SBA与这些整联蛋白之间的作用关系及连接方式,为揭示SBA的抗营养机制提供重要的研究证明和理论依据。试验一:IPEC-J2细胞中整联蛋白亚基的鉴定采用细胞膜蛋白提取试剂盒提取IPEC-J2细胞膜蛋白,通过SDS-PAGE电泳分离细胞膜蛋白,根据整联蛋白分子质量为80-220 kDa的特点,将此区段的凝胶条带进行质谱(Q-TOF)分析。采用免疫印迹的方法对质谱检测的整联蛋白亚基结果进行二次鉴定。质谱与免疫印迹试验的检测结果发现:分布于IPEC-J2细胞膜蛋白上的整联蛋白亚基种类为5种,分别为α2,α3,α6,β1和β4。试验二:整联蛋白在IPEC-J2细胞增殖,细胞周期,细胞凋亡以及SBA引起IPEC-J2细胞周期与凋亡改变中的作用采用浓度为0,0.125,0.25,0.5,1.0和2.0 mg/mL SBA处理IPEC-J2细胞24 h,通过CCK-8试剂盒检测不同水平SBA对IPEC-J2细胞增殖的影响,采用流式细胞仪测定SBA对IPEC-J2细胞周期及凋亡的影响。通过荧光定量PCR测定SBA处理前后,细胞周期相关基因CDK4,Cyclin E和Cyclin D1 mRNA表达量的变化情况。分别采用作用浓度为0,5,10及20μg/mL的整联蛋白(α2,α3,α6,β1及β4)功能性抑制剂处理细胞24 h,用CCK-8试剂盒检测不同整联蛋白抑制剂对IPEC-J2细胞增殖的影响,同时筛选出整联蛋白亚基抑制剂的最佳作用浓度。利用所筛选出的最佳作用浓度的SBA与整联蛋白抑制剂进行整联蛋白功能性抑制试验。试验主要分为4组,分别为:0 mg/mL SBA处理组(对照组);SBA处理组;整联蛋白抑制剂处理组;以及整联蛋白(α2,α3,α6,β1及β4)抑制剂+SBA处理组,试验24 h后,检测不同整联蛋白亚基抑制剂在IPEC-J2细胞增殖,周期,凋亡以及SBA引起的IPEC-J2细胞周期与凋亡改变中的作用。试验结果表明:不同水平的SBA会通过阻滞IPEC-J2细胞周期于G0/G1期而显著降低细胞增殖(P0.05),引起细胞凋亡(P0.05)。SBA会显著下调细胞周期关键基因CDK4,Cyclin E和Cyclin D1的mRNA表达水平。整联蛋白α2,α3,α6,β1和β4是维持IPEC-J2细胞正常增殖,周期及凋亡的重要蛋白,功能性抑制任何一种亚基均会引起细胞周期阻滞于G0/G1期(P0.05),抑制IPEC-J2细胞增殖(P0.05),促进细胞凋亡(P0.05)。除此之外,整联蛋白α2,α6和β1参与SBA引起的IPEC-J2细胞周期改变过程(P0.05),而整联蛋白α2,α3,α6,β1及β4参与SBA引起的IPEC-J2细胞凋亡过程。试验三:SBA与整联蛋白作用关系与连接方式的研究采用2.0 mg/mL SBA处理IPEC-J2细胞24 h,通过荧光定量PCR检测SBA对整联蛋白亚基α2,α3,α6,β1和β4 mRNA表达水平的影响;采用免疫共沉淀的方法分离IPEC-J2细胞膜上的SBA特异性结合蛋白,通过质谱(Q-E)对SBA结合蛋白进行鉴定;利用荧光定量PCR测定2.0 mg/mL SBA对α-辅肌动蛋白-2(ACTN2)基因表达量的影响;采用ACTN2-siRNA序列处理IPEC-J2细胞24 h,通过荧光定量PCR技术探索ACTN2与整联蛋白(α2,α3,α6,β1和β4)基因表达水平之间的作用关系。试验结果显示:SBA显著下调整联蛋白α2,α3,α6,β1及β4的mRNA表达量(P0.05)。IPEC-J2细胞膜上含有67种SBA特异性结合蛋白,在这些SBA特异性结合蛋白中,不存在任何一种整联蛋白亚基,说明SBA与整联蛋白之间没有发生直接连接作用,但是从检测结果中发现了整联蛋白连接蛋白,α-辅肌动蛋白-2(ACTN2,Accession:F1RHL9),且SBA会显著降低ACTN2的mRNA表达量(P0.05)。除此之外,ACTN2基因沉默后,α2,α3,α6,β1及β4 mRNA表达量也随着显著降低(P0.05),表明SBA可能通过降低ACTN2基因表达水平,影响ACTN2与整联蛋白之间的作用关系,降低整联蛋白的mRNA表达量。综上所述,表达于IPEC-J2细胞膜上的整联蛋白亚基为α2,α3,α6,β1和β4,这些整联蛋白亚基是维持IPEC-J2细胞正常代谢的重要蛋白。SBA可通过与ACTN2结合间接引起整联蛋白基因表达量及功能的改变,进而影响IPEC-J2细胞增殖,周期及凋亡等生命活动。以上研究结果为揭示SBA的抗营养机制提供重要的依据,同时整联蛋白也可为如何改善SBA引起肠道增殖抑制和凋亡等领域的研究提供一条重要的研究思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S828

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本文编号：2404223