白牦牛消化道线虫PCR-RFLP鉴定方法的建立及遗传变异研究

发布时间：2019-01-09 11:01

【摘要】：消化道线虫(Nematodes in digestive canal)主要寄生在牛(包括牦牛)、羊、骆驼等反刍动物的消化道中。一般呈多虫种混合感染,主要导致宿主消化道机械性损伤,并发胃肠道炎症,食欲不振,贫血消瘦等症状,大量寄生时引起宿主消化道阻塞,严重时可造成宿主死亡,造成畜牧业经济的极大损失。准确进行消化道线虫分类,研究其遗传变异关系和种群特征,对消化道线虫病的防治和病原学研究均有重要意义。本研究以采自天祝白牦牛小肠的3种线虫为对象,从分子鉴定和遗传变异的角度分别进行了相关研究和分析。1.采用核糖体内转录间隔区序列扩增和测序的方法,对采自甘肃省天祝县国家保种动物白牦牛消化道的3种线虫进行了研究。结果显示肿孔古柏线虫(Cooperia oncophora),环背带线虫(Teladorsagia circumcincta)和奥斯特线虫sp.(Ostertagia sp.)的ITS序列长度分别为779bp,791bp和765bp。三种线虫ITS序列的种内差异均在为0.5%以下。其中肿孔古柏线虫与奥斯特线虫的ITS序列差异最大,为13.6%~13.9%;肿孔古柏线虫与环纹背带线虫ITS序列差异为12.9%-13.1%;环纹背带线虫和奥斯特线虫ITS序列的差异最小,为4.3%~4.8%。通过对三种线虫的ITS序列的比对分析可知,以ITS序列作为分子标记可以对不同虫种进行准确鉴别。2.根据内转录间隔区序列的差异,利用PCR-RFLP技术成功建立了区分3种线虫的分子生物学方法。结果显示该技术可准确将3种形态相近的线虫区分。试验采用的限制性内切酶分别是Nde I和Eco R V,通过两次酶切反应即将3种线虫成功区别。其中,能被两种酶切开的是肿孔古柏线虫,只能被Nde I酶切开的是环背带线虫,两种酶均无法切开的是奥斯特线虫。相对于传统形态学方法,此方法有操作简便、区分效率高的特点。3.对采自甘肃省天祝县西大滩乡和抓西秀龙乡白牦牛小肠的14条环背带线虫nad6基因全序列进行扩增、测序并分析。结果显示,14条环背带线虫样本的nad6全序列长度均为438bp,核苷酸种内差异为1.1-2.3%,氨基酸种内差异为0.7%-2.7%;进化树显示和环纹背带线虫日本株和印度株没有明显分支。对采自甘肃省天祝县西大滩乡和抓西秀龙乡白牦牛皱胃的15条肿孔古柏线虫nad6基因全序列进行扩增、测序并分析。结果显示,15条肿孔古柏线虫样本的nad6全序列长度均为438bp,核苷酸种内差异为0.9-1.8%,氨基酸种内差异0.7-1.4%;进化树显示和肿孔古柏线虫澳大利亚株有明显分枝。4.对肿孔古柏线虫天祝株的线粒体全基因组进行了扩增并测序,结果表明肿孔古柏线虫线粒体全基因组长度为13583bp,闭环结构,共包含36个基因,其中12个编码蛋白的基因,22个t RNA,2个r RNA,无atp8基因。ITS序列比对显示其和已发布的肿孔古柏线虫的ITS序列差异在0.5%以下,但线粒体全序列和已发布的肿孔古柏线虫GQ888713比对显示差异为12.2%,超出了一般的种内差异,可以将其视为肿孔古柏线虫的姊妹种。本研究结果完善了肿孔古柏线虫遗传进化的数据库。本研究明确了甘肃省天祝县国家保种动物白牦牛的三种常见胃肠道线虫的ITS序列,nad6序列和部分虫种的线粒体全基因组,并建立了区分这三种线虫的分子生物学方法,同时分析了其遗传进化关系和群体结构,为我国的寄生虫研究提供了基础数据,丰富了寄生虫病的防治理论基础。
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【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.7
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本文编号：2405534