A亚群禽白血病病毒gp85囊膜蛋白原核表达及初步应用

发布时间：2019-02-24 11:54

【摘要】：A亚群禽白血病(Avian leukosis,AL)是由A亚群禽白血病病毒(ALV-A)引起的传染性肿瘤病病,可造成感染鸡群的免疫力下降、产蛋率和蛋品质降低、生长迟缓等。该病在我国鸡群中广泛流行,对我国养禽业造成严重威胁。我国政府和科技工作者对该病高度重视,采取净化种鸡群、阻断垂直传播的防控策略来控制该病。由于缺乏针对ALV-A特异性诊断试剂和疫苗抗原,限制了对该病的净化检测和疫苗防治的研究。本研究利用ALV-A gp85基因进行了A亚群单克隆抗体的制备与ALV-A基因工程亚单位疫苗抗原的免疫保护作用评价试验,为建立ALV-A特异性诊断方法和探索新型防治方法提供科学依据。ALV-A gp85基因的克隆与表达。根据已发表基因序列,设计引物,从感染ALV-A-SDAU09C1病毒的DF1细胞中获得病毒全基因组DNA,以此为模板扩增获得大小为909bp的gp85目的基因,利用该基因构建重组表达质粒(pET32a-SDAU09C1-gp85),经IPTG诱导后获得高效表达的大小约为46KD的目的蛋白;该蛋白经纯化、乳化后制备成免疫抗原。ALV-A gp85重组蛋白抗原的免疫保护性研究。将纯化后的gp85重组蛋白与不同佐剂(弗氏佐剂和CpG佐剂)进行乳化、混合,制备ALV-A免疫原,免疫60周龄农大三号种母鸡,首次免疫后每隔3周进行两次加强免疫,于首免后每周检测血清ALV-A抗体,并与卵黄抗体比较分析。对种鸡进行人工授精,收集受精种蛋、孵化,对孵化的1日龄雏鸡进行攻毒。攻毒后4周对雏鸡进行病毒血症、泄殖腔棉拭子p27进行检测,并观察鸡只状态及统计死亡率,同时进行血清抗体病毒中和试验。结果显示:(1)使用ALV-A gp85重组蛋白与不同佐剂可以诱导全部种鸡产生较高效价的血清抗体和卵黄抗体,其中CpG佐剂联合免疫组效果优于其它免疫组。(2)gp85联合CpG佐剂组与对照组相比,雏鸡的病毒血症、泄殖腔排毒率和死亡率均显著降低。(3)体外病毒中和试验表明,诱导产生的雏鸡体内母源抗体可以中和ALV-A病毒,其中和作用与抗体滴度高低呈现正相关;免疫荧光分析(IFA)试验证实抗体与病毒的结合。ALV-A单克隆抗体的制备。以制备的gp85重组蛋白抗原免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,三次加强免疫后制备脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选,获得一株分泌抗ALV-A抗体的杂交瘤细胞株,命名为A14GZ。对该单抗进行ELISA效价测定、IFA和免疫组化方法鉴定,结果显示:(1)ELISA法测定的细胞上清效价为1:26,腹水效价为1:213;(2)IFA鉴定显示该单抗能特异性识别ALV-A病毒;不与ALV-J、ALV-B结合(3)取已知感染ALV-A病毒鸡只的心肌组织,制作切片,并作A亚群单克隆抗体介导的IFA检测,可见心肌细胞质特异性绿色荧光。以上结果表明,利用原核表达系统成功的获得了具有良好免疫原性的ALV-A gp85重组蛋白,联合佐剂能够诱导鸡体产生的较高ALV-A血清抗体和母源抗体,对后代雏鸡具有较好的抗ALV-A早期感染的作用,保护率可达80%。同时,利用ALV-A gp85重组蛋白获得一株能稳定分泌ALV-A单克隆抗体的杂交瘤细胞株A14GZ,分泌的抗体可用于ALV-A感染的鉴别诊断。
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【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

【参考文献】