猪骨骼肌miRNA转录组分析及miR-486功能的初步研究

发布时间：2019-03-04 14:54

【摘要】：MicroRNA是长度约为22nt的小分子RNA,在转录后水平调控基因的表达。miRNA参与肌肉组织生长发育相关的一系列生物过程,包括肌肉细胞的增殖、分化、肥大、肌纤维类型转换及肌肉疾病的发生。相对于源自丹麦的长白猪,广西巴马小型猪具有体型矮小、生长速度慢、瘦肉率低、肉质更好的特征。目前,比较小型猪与正常体型猪肌肉组织发育相关的miRNA研究报道较少。探索巴马小型猪和长白猪骨骼肌miRNA的差异表达,对于解析品种间肌肉生长发育差异分子机理具有重要的意义。本研究分别构建巴马小型猪和长白猪出生后1日龄和180日龄背最长肌组织小RNA文库,利用高通量测序技术鉴定肌肉发育相关的miRNA,检测miRNA的表达谱,并对差异表达miRNA的靶基因进行注释和信号通路富集,分析目的miRNA的潜在功能。采用QRT-PCR对10个差异表达miRNA进行了验证,并检测它们的组织表达谱及在背最长肌中的发育性变化规律,分析它们在肌肉发育过程中的可能功能。猪miR-486的表达和功能研究还未见报道,为了解析miR-486的表达差异,本研究利用RACE技术克隆miR-486宿主基因sANK1的cDNA全长序列,对miR-486与其宿主基因的表达进行相关性分析,并分析其启动子的功能;为了解猪miR-486的生物学功能,本研究对miR-486进行了靶基因预测和功能分析,检测巴马小型猪和长白猪背最长肌中靶基因涉及的IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信号通路相关基因的表达规律,在C2C12成肌细胞上验证miR-486对肌肉发育的影响和可能的机制。本研究获得的主要结果总结如下:1.巴马小型猪与长白猪背最长肌小RNA文库测序。分别构建1日龄和180日龄巴马小型猪(NB和AB组)及长白猪(NL和AL组)背最长肌小RNA文库,并进行高通量测序,结果显示4个小RNA文库分别获得的高质量序列读数分别为11955887、11975536、11955924和11975035,其中绝大多数序列长度在22nt,与哺乳动物miRNA的大小一致。去除冗余序列后4个文库获得长度为18nt-30nt的clean reads读数分别为11925255、11934400、11934796 和 11931683,对应的种类数分别为 125347、121867、152944和136903。四个文库中有大约85%的total序列与猪基因组匹配,50%以上的unique序列未与猪基因组匹配。NB与AB、NL与AL、NB与NL和AB与AL文库间共有序列种类分别为30588、31861、39840和33533。分类注释显示,NB、AB、NL和AL文库中与已知的猪miRNA序列相匹配的序列数分别为85.52%、87.05%、81.94%和87.13%,未被注释的序列数分别占序列总数的 13.11%、11.79%、16.08%和 11.76%。2.巴马小型猪与长白猪背最长肌小RNA表达谱及差异分析。应用生物信息学技术分析小RNA表达谱,从四个文库中共鉴定获得292种已知的猪miRNA,利用Mireap软件预测获得86个候选miRNA,并采用RT-PCR成功验证了其中的9个候选miRNA。miRNA差异表达分析显示:180日龄巴马小型猪与1日龄巴马小型猪相比,有151个差异表达的miRNA,其中18个显著上调,133个显著下调;180日龄长白猪与1日龄长白猪相比,有161个差异表达的miRNA,其中21个显著上调,140个显著下调。1日龄巴马小型猪与1日龄长白猪相比,有29个差异表达的miRNA,其中20个显著上调,9个显著下调:180日龄巴马小型猪与180日龄长白猪相比,有30个差异表达的miRNA,其中显著上调26个,显著下调4个。为了验证小RNA测序结果,克隆了猪10个miRNA的成熟体序列,并进行QRT-PCR检验,证实了小RNA文库测序的结果可靠。3.差异表达miRNA的功能分析。差异表达小RNA的GO注释分析结果显示,NB与NL样品间差异miRNA靶基因在细胞成分中显著富集;AB与AL样品间差异miRNA靶基因在生物学过程和分子功能中显著富集。KEGG通路分析结果显示巴马小型猪与长白猪在1日龄中差异表达miRNA靶基因显著富集到12个通路,包括Notch信号通路、扩张型心肌病和肥厚性心肌病等;巴马小型猪与长白猪在180日龄中差异表达的miRNA靶基因显著富集到14个通路,包括磷脂酰肌醇信号系统、乙醛酸和二羧酸代谢、赖氨酸降解、血管平滑肌收缩通路等。4.10个高丰度差异表达miRNA的组织表达谱和表达规律以及功能分析。利用 QRT-PCR 的方法,检测了 10 个 miRNA(miR-1,miR-133a-3p,miR-148,miR-206,miR-486,miR-378,miR-181a/b 和 miR-103/107)在180日龄巴马小型猪和长白猪中的组织表达谱及它们在猪出生后5个不同发育时期(Day1、Day30、Day60、Day90和Day180)背最长肌的表达规律。结果显示 miR-103/107、miR-148、miR-181a/b 在组织中广泛表达,miR-1/133和miR-378在肌肉中特异性表达,miR-486在肌肉中高丰度表达,miR-206仅在骨骼肌中特异表达;同时,这些miRNA在背最长肌中的表达呈现显著的日龄和品种差异性。10 个 miRNAs(miR181a/b、miR-103/107、miR-206、miR-378、miR-486、miR-499-5p、miR-423-5p 和 miR-432-5p)功能分析结果显示:预测的靶基因在肌肉发育相关通路、肌肉疾病相关通路、细胞生物学过程相关通路、代谢相关通路以及神经发育相关通路5大方面显著富集。这些结果提示miRNA在猪肌肉发育中发挥重要的作用,可能影响巴马小型猪和长白猪之间肌肉生长和肉质性状的差异。5.猪miR-486宿主基因ANK1在肌肉中新转录本的鉴定。本研究首次应用RACE技术验证了猪ANK1在39号内含子中存在新的选择性外显子1(exon39a),形成了 ANK1短转录本sANK1基因,提示miR-486可能选择较近内含子作为其启动子。通过全长cDNAPCR策略,克隆和分析了转录本的特征,结果显示猪sANK1基因编码区存在3种ORF序列,可以形成3种可变剪接体(sANK1-1,sANK1-2和sANK1-3)。生物信息学分析结果表明猪sANK1的3种可变剪接体是功能比较活跃的蛋白,可能参与信号传导和细胞生长调控等一系列生物过程。6.miR-486与宿主基因sANK1基因的表达相关性分析。猪miR-486与其宿主基因的表达关系研究结果显示:猪miR-486在DNA和cDNA中均可通过PCR扩增获得,且ANK1基因存在正常的外显子剪切,表明miR-486的初始转录本与宿主基因ANK1基因的转录本共表达。半定量PCR结果显示miR-486在肌肉组织中表达量最高,sANK1在心肌、背最长肌和股二头肌中特异性表达,说明二者在肌肉发育中均具有重要作用。QRT-PCR结果显示miR-486和宿主sANK1基因在猪出生后背最长肌生长发育过程中和C2C12细胞分化过程中的表达均呈相似的上升趋势。表达相关性分析结果表明miR-486与sANK1基因在肌肉发育中的表达呈现正相关,其中,在巴马小型猪背最长肌中相关系数为r2=0.773(P=0.125);在长白猪中相关系数为r2=0.698(P=0.19);在C2C12成肌细胞分化过程相关系数为r2=0.999(P0.05)。这些结果进一步证实miR-486与sANK1基因在猪肌肉组织中共享同一个启动子。7.miR-486/sANK1基因在巴马小型猪和长白猪背最长肌中差异表达的机制。QRT-PCR结果显示miR-486在1、60、90和180日龄巴马小型猪中的表达量高于长白猪,sANK1基因在60、90、180日龄巴马小型猪中的表达量高于长白猪。为了解析miR-486/sANK1基因在巴马小型猪和长白猪中的表达差异,克隆猪miR-486/sANK1基因的启动子,并分析启动子区SNP和转录因子结合位点。结果显示启动子区存在18个SNP位点,其中有14个SNP位点导致转录因子结合位点的改变。通过构建巴马小型猪和长白猪miR-486/sANK1 启动子表达载体 pEGFP-BP1、pEGFP-BP2、pEGFP-LP1、pEGFP-LP2,并在不同细胞中验证了启动子的功能,结果显示启动子只在C2C12细胞中具有较强的启动功能,说明启动子具有肌肉特异性;P1片段启动子的活性显著高于P2片段的活性(P0.01);BP1和BP2启动子活性均分别极显著高于LP1和LP2启动子活性(P0.01),表明巴马小型猪sANK1启动子活性高于长白猪。进一步分析结果显示巴马小型猪启动子区-401位碱基由A突变成G产生了转录因子MyoD的结合位点,这可能导致巴马小型猪与长白猪sANK1启动子活性的差异,进而影响miR-486/sANK1基因的表达。8.IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信号通路相关基因在巴马小型猪和长白猪背最长肌中的表达规律。本实验克隆了猪p85α(PI3KR1)基因完整的CDS序列,结果显示巴马小型猪p85α基因CDS序列长2175bp,生物信息学分析发现它具有SH3和SH2结构域及与信号传导相关的RhoGAP结构域,能够与IRS1、PTEN、IRS2等蛋白互作。利用QRT-PCR检测IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信号通路各基因在巴马小型猪和长白猪出生后5个不同发育时期(Day1、Day30、Day60、Day90和Day180)背最长肌的表达情况,结果显示PTEN、FoxO1和4EBP1基因在两个品种各个日龄中的表达量均显著高于其他基因(P0.05),而且,IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信号通路各基因在背最长肌中的表达呈现显著的日龄和品种差异性,这种差异可能是影响巴马小型猪和长白猪肌肉性状差异的原因之一。9.miR-486在IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信号通路中的作用。本研究结果表明,在正常的生理条件下,miR-486与靶基因IGF-1、p85α、PTEN和FoxO1基因在猪出生后背最长肌的生长发育过程中的表达呈现负相关。C2C12细胞中分别过表达和抑制miR-486,利用QRT-PCR检测细胞中IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信号通路相关基因的表达。结果显示:过表达miR-486 抑制了 PTEN 和 FoxO1 基因的表达,同时 INSR、IRS1、AKT1、PDK1、mTOR和4EBP1基因的mRNA表达水平也下调;抑制miR-486 24h时p85α和PTEN基因的表达上调,同时PDK1、和4EBP1基因也显著上调,但抑制48h时IGF-1的表达显著上调而4EBP1基因显著下调。综上结果表明miR-486在猪骨骼肌中通过调节靶基因的表达,进而调控IGF-1-PI3K/AKT-mTOR 信号通路。
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【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828
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本文编号：2434367