猪乙型脑炎灭活苗毒株筛选及其免疫原性评价

发布时间：2019-07-13 15:57

【摘要】：流行性乙型脑炎,又称日本乙型脑炎,是一种由虫媒介导传播的人兽共患病。给人类健康和生猪养殖业带来巨大危害,接种疫苗是防治该病的主要手段。目前国内猪乙型脑炎疫苗毒株都是基因Ⅲ型,随着优势基因型从Ⅲ型逐步转换成Ⅰ型,开发基因Ⅰ型疫苗显得尤为迫切,本研究是通过制备基因Ⅰ型乙型脑炎病毒灭活苗,筛选出具有优秀免疫原性的候选毒株。成功制备出了灭活苗,并通过小鼠免疫试验、豚鼠免疫试验、小鼠攻毒保护试验和仔猪免疫试验初步筛选出两株免疫原性较好的毒株。1.分离株的鉴定和毒株初步筛选1)分离株生物学特征研究:通过对病毒的复苏,得到能够稳定传代的四株(YA1、YA2、MY]、CZ1株)病毒,经过RT-PCR鉴定为乙型脑炎病毒。在BHK-21细胞和鼠脑传代制备出了不同的病毒液,通过测定四种毒株的TCID50和LD50发现鼠脑传代后的病毒TCID50显著升高,LD50显著下降。病毒在BHK-21细胞传达后滴度在104.6-105.8TCID50/0.2ml之间,鼠脑传代后病毒滴度显著上升,达到1011.8-1012.3TCID50/0.2ml,细胞传代后半数致死量在10-3.5-10-4.2/0.025ml之间,鼠脑传代后半数致死量显著下降,LD50在10-7.3-10-6.3/0.025ml之间,因此选择鼠脑病毒液作为制备灭活苗的病毒液。2)灭活苗的制备:将制备好的鼠脑病毒液通过甲醛灭活,通过灭活条件的优化实验,确立了 0.05%甲醛在37℃灭活48h的最佳灭活条件,通过剂型检验、稳定性检验、无菌检验和安全性检验制备出了质量合格的四种毒株鼠脑灭活苗。3)毒株初步筛选:在制备出合格疫苗的基础上,开展小鼠免疫试验,通过腹腔接种后监测小鼠血清JEV抗体水平,初步筛选免疫原性较好的毒株。结果显示四种毒株制备的疫苗都具有良好的免疫原性,在二免后两周YA1株和CZ1株组的小鼠抗体水平显著高于商品化灭活苗组(P0.01),在二免后4周所有分离株组的小鼠抗体水平都显著高于商品化灭活苗组(P0.01),但在绝对数值上YA1株和CZ1株组小鼠抗体水平更高,初步筛选出免疫原性较优的YA1株和CZ1株。2.候选毒株免疫原性研究1)豚鼠免疫试验:在初步筛选出YA1株和CZ1株后,开展了豚鼠免疫试验进一步评价了两毒株作为猪乙型脑炎灭活苗候选毒株的可能性,豚鼠试验显示CZ1株和YA1株都能使100%的豚鼠产生合格的血凝抑制抗体,相对于商品化灭活苗阳性转化率更高、血凝抑制抗体效价也更高,二者之间CZ1株组豚鼠产生的血凝抑制抗体水平显著高于YA1株组(P0.05)。2)小鼠攻毒保护试验:疫苗在免疫3周龄小鼠后1周加强免疫一次,二免后1周使用1OLD50脑内攻毒,结果显示YA1株疫苗对小鼠的保护率为70%,CZ1株疫苗对小鼠的保护率为80%,而商品化的鼠脑灭活苗和减毒活疫苗的保护率分别为60%和70%。两毒株都显示出了优良的保护力,CZ1株的保护力则更优。3)仔猪免疫试验:仔猪免疫试验结果显示两个毒株都能使仔猪的抗体阳性转化率达到100%,相对于商品化灭活苗抗体水平和中和抗体效价更高。同时抗体水平与前文的豚鼠免疫试验、小鼠攻毒保护试验结果相符,二者之间CZ1株的免疫原性更好。
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图片说明： 图３．２邋４株病毒ＲＴ－ＰＣＲ检测逡逑ｉｇ．３．２邋ＲＴ－ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｆｏｕｒ邋ｖｉｒｕｓ邋ｓｔｒａｉｎｓ逡逑ｌｌ；邋１邋？４邋分别为邋ＹＡ１、ＹＡ２、ＭＹ１、ＣＺ１邋株邋ＲＴ－ＰＣＲ邋检测结果；逡逑５．空白对照组；７．阳性对照组逡逑１－４．ＲＴ－ＰＣＲ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＹＡ１，ＹＡ２，ＭＹ１邋ａｎｄ邋ＣＺ１邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；邋５．邋Ｂｌａｎｋ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邋；邋６．邋Ｔｈｅ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑
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图片说明： Ｆｉｇ邋３．４邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｆｉｖｅ邋ｋｉｎｄｓ邋ｏｆ邋ｉｍｍｕｎｅ邋ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ逡逑４讨论逡逑目前预防猪乙型脑炎病毒的疫苗主要是减毒活疫苗，该疫苗毒株为人用疫苗毒逡逑株，为基因ＩＩＩ型病毒，而国内乙型脑炎优势基因型已经从ＩＩＩ型转变为１型［１２］，同时逡逑又有研宄指出，免疫基因ＩＩＩ型疫苗只能对部分基因Ｉ型病毒产生保护力［６５］。在此背逡逑景下，研制出安全、有效的基因Ｉ型猪乙型脑炎灭活苗显得尤为迫切。逡逑本研宄使用的四个毒株都是基因Ｉ型病毒，，ＹＡｌ、ＹＡ２、ＭＹ１为猪源毒株，ＣＺ１逡逑为蚊源毒株。在ＢＨＫ－２１细胞上都能稳定传代，但是病毒的滴度（ＴＣＩＤ５Ｇ）较低，逡逑同时对乳鼠的半数致死量（ＬＤ５0）也较高，因此ＢＨＫ－２１细胞病毒液不能作为疫苗逡逑生产用病毒液。将病毒经过鼠脑传代后，病毒滴度都有了较大的提升，乳鼠半数致逡逑死量大幅降低。由于乳鼠为其敏感试验动物，乳鼠脑内接种相对于ＢＨＫ－２１细胞接逡逑
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4

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本文编号：2514106