基于P48重组蛋白的牛支原体抗体检测技术研究

发布时间：2019-07-18 07:23

【摘要】：牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是感染牛的一种致病性病原体,主要引起牛乳腺炎、肺炎、关节炎、中耳炎,也可引起角膜炎、结膜炎等疾病,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。2008年,我国首次报道了M.bovis引起的犊牛传染性肺炎,并造成了很大损失。目前,牛支原体感染已成为危害我国养牛业的重要疾病之一。但我国迄今尚无特异、敏感的M.bovis抗体检测试剂,缺乏有效的流行病学技术手段,这给牛支原体病的预防控制带来了困难。本研究利用牛支原体P48重组蛋白,建立了检测M.bovis抗体的间接血凝试验方法和胶体金免疫层析试纸条,并完成了试剂盒组装、实验室试制和质量研究,为牛支原体病的诊断和流行病学调查提供了有效工具,对本病的预防控制具有重要意义。本研究第一部分为M.bovis抗体的间接血凝试验方法和胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立。在参考文献的基础上,优化并合成牛支原体的p48基因,克隆到p ET32a(+)表达载体上后,转化大肠杆菌BL21(DE3),16℃低温长时间诱导,获得部分可溶性表达的P48重组蛋白。经Western-blot检测,纯化的P48重组蛋白能与M.bovis高免血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。以纯化的P48重组蛋白致敏醛化-鞣酸化的绵羊红细胞,建立了检测牛支原体抗体的间接血凝试验方法(IHA)。P48重组蛋白致敏红细胞的最佳浓度是20~40μg/m L,M.bovis高免血清抗体效价达1:211。该方法对牛肺疫、牛巴氏杆菌病、牛病毒性腹泻病、布氏杆菌病、结核病、口蹄疫、牛生殖道支原体感染、里奇氏支原体感染、大肠杆菌病阳性血清检测均为阴性。分析特异性为100%,分析敏感性为93.33%。与国外商品化的ELISA试剂盒比较,平均符合率为96.15%。对833份田间血清和1084份乳清进行检测,阳性率分别是15.37%和19.56%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强和重复性好,可用于牛支原体抗体水平检测、牛支原体病的辅助诊断和流行病学调查。利用合适粒径的胶体金颗粒在p H7.4条件下标记6μg/m L P48重组蛋白作为金标抗原包被金标垫、山羊抗牛Ig G(H+L)二抗包被检测线(T线)、兔抗P48重组蛋白Ig G多抗包被质控线(C线),组装成胶体金免疫层析试纸条(ICS)。该试纸条检测M.bovis高免血清,效价可至1:106。检测上述相近病原或者类症病原阳性血清,不发生交叉反应。与IHA方法相比,阳性符合率为93.57%,阴性符合率为93.02%,平均符合率为96.53%。检测临床血清200份,乳清108份,阳性率分别是21.50%、17.59%。结果表明该试纸条敏感、特异、快速,适合于牛支原体抗体的快速检测。本研究第二部分依据农业部683号公告对两种方法进行实验室试制和质量研究。建立了生产试剂盒用的种子批,规范了阴、阳性对照血清的制备和检验方法,并试制了两种试剂各3批。对3批试剂分别进行了敏感性、特异性、重复性和保存期试验,结果实验室试制的两种试剂质量稳定,检测结果可靠,为下一步申报新兽药证书积累了实验数据。
文内图片：胶体金免疫层析试纸条特异性试验检测Fig.4.3Specificitydetectionofcolloidalgoldimmunoassayteststrip(1~12分别为牛支原体阳性血清、健康牛血清即阴性对照、空白对照、牛肺疫阳性血清、牛巴氏杆菌病阳性血清、牛病毒性腹泻病阳性血清、布氏杆菌病阳性血清、结核病阳性血清、口蹄疫阳性血清、里奇氏支原体感染阳性血清、牛生殖道支原体感染阳性血清、大肠杆

胶体金免疫层析试纸条特异性试验检测Fig.4.3Specificitydetectionofcolloidalgoldimmunoassayteststrip(1~12分别为牛支原体阳性血清、健康牛血清即阴性对照、空白对照、牛肺疫阳性血清、牛巴氏杆菌病阳性血清、牛病毒性腹泻病阳性血清、布氏杆菌病阳性血清、结核病阳性血清、口蹄疫阳性血清、里奇氏支原体感染阳性血清、牛生殖道支原体感染阳性血清、大肠杆

图片说明：图 4.3 胶体金免疫层析试纸条特异性试验检测Fig.4.3 Specificity detection of colloidal gold immunoassay test strip2 分别为牛支原体阳性血清、健康牛血清即阴性对照、空白对照、牛肺疫阳性血清、牛巴氏杆菌病阳性血清、牛病毒性腹泻病阳性、布氏杆菌病阳性血清、结核病阳性血清、口蹄疫阳性血清、里奇氏支原体感染阳性血清、牛生殖道支原体感染阳性血清、大肠杆菌病阳性血清）.5 敏感性试验将牛支原体高免血清稀释成不同滴度 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，同时设立健康清的阴性对照，以及样品稀释液作为空白对照，试纸条检测结果为：阴性对照、空白对照均，血清滴度从 10-1~10-6检测结果均为阳性，血清滴度 10-7的检测结果为阴性。
文内图片：胶体金免疫层析试纸条敏感性试验检测Fig.4.4Sensitivitydetectionofcolloidalgoldimmunoassayteststrip

胶体金免疫层析试纸条敏感性试验检测Fig.4.4Sensitivitydetectionofcolloidalgoldimmunoassayteststrip

图片说明：图 4.3 胶体金免疫层析试纸条特异性试验检测Fig.4.3 Specificity detection of colloidal gold immunoassay test strip12 分别为牛支原体阳性血清、健康牛血清即阴性对照、空白对照、牛肺疫阳性血清、牛巴氏杆菌病阳性血清、牛病毒性腹泻病、布氏杆菌病阳性血清、结核病阳性血清、口蹄疫阳性血清、里奇氏支原体感染阳性血清、牛生殖道支原体感染阳性血清、大菌病阳性血清）2.5 敏感性试验将牛支原体高免血清稀释成不同滴度 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，同时设立血清的阴性对照，，以及样品稀释液作为空白对照，试纸条检测结果为：阴性对照、空白对立，血清滴度从 10-1~10-6检测结果均为阳性，血清滴度 10-7的检测结果为阴性。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.23

【参考文献】