猪流行性腹泻病毒S蛋白富含表位区域的原核表达与鉴定

发布时间：2019-07-22 11:15

【摘要】：猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪腹泻的重要病原之一,给世界养猪业带来严重危害。本研究对PEDV分离株JS-2纤突蛋白(S)进行抗原表位分析,选择3个富含表位片段的区域。通过RT-PCR扩增基因序列,克隆入p ET32a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并进行诱导表达,SDS-PAGE电泳显示,成功表达了3个重组蛋白,分子质量与预期大小一致。将蛋白进行割胶回收,与油佐剂乳化后免疫小鼠,制备超免疫血清,利用PEDV包被抗原进行ELISA检测,结果免疫小鼠血清D450值达1.0左右,证实筛选制备的重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。
【图文】：

TheinducedcontrolofCOE；8：pET-28a（＋）图2重组质粒双酶切鉴定Fig.2DoublerestrictiveenzymedigestionofrecombinantplasmidM：DNA分子质量标准；1：pET32a质粒的双酶切产物；2：pET32a-S-1质粒的双酶切产物；3：pET32a-S2-1质粒的双酶切产物；4：pET32a-COE质粒的双酶切产物M：DL10000DNAMarker；1：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a；2：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a-S-1；3：Dou-blerestrictiveenzymedigestionofpET32a-S2-1；4：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a-COE图1PCR扩增结果Fig.1PCRproductofgeneM：DNA分子质量标准；1：S-1（1184bp）；2：S2-1（439bp）；3：COE（433bp）M：DL2000DNAMarker；1：S-1（1184bp）；2：S2-1（439bp）；3：COE（433bp）2.4ELISA检测同时检测免前血清、一免后第7天的血清、二免后第7天的血清、三免后第7天的血清及三免后第14天的血清中的IgG抗体水平。结果见图5所示。IgG水平随免疫次数的增加而显著升高，4组间差异不显著。2.5Western-blot检测将各蛋白的超免疫血清与其进行Western-blot检测，结果（见图6）发现，出现特异性目的条带，证明这3个蛋白均能与其各自血清发生较好反应。3讨论猪流行性腹泻病毒广泛存在于世界各国养猪场中，导致猪群发生急性、高度传染性消化道疾玻近几年，该病在中国广泛蔓延，，造成严重经济损失。目前PEDV商品化疫苗保护效力在逐年降低，其中M1232000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM123410000bp7000bp4000bp2000bp1000bp500bp250bpM12345678980hu60ku40ku30ku20ku12ku80hu60ku40ku30ku20ku12ku80hu60ku40ku30ku20ku12ku123M45678M906

重组质粒双酶切鉴定Fig.2Doublerestrictiveenzymedigestionofrecombinant500bp250bp

炯觳?Fig.3SDS-PAGEanalysisexpressionproteinM：蛋白质分子质量标准；1：S1-1蛋白诱导表达前；2：S1-1蛋白诱导表达后；3：诱导空载体pET-28a（＋）；4：S2-1蛋白诱导表达前；5：S2-1蛋白诱导表达后；6：COE蛋白诱导表达前；7：COE蛋白诱导表达后；8：诱导空载体pET-28a（＋）M：ProteinMarker；1：TheuninducedcontrolofS1-1；2：TheinducedcontrolofS1-1；3：pET-28a（＋）；4：TheuninducedcontrolofS2-1；5：TheinducedcontrolofS2-1；6：TheuninducedcontrolofCOE；7：TheinducedcontrolofCOE；8：pET-28a（＋）图2重组质粒双酶切鉴定Fig.2DoublerestrictiveenzymedigestionofrecombinantplasmidM：DNA分子质量标准；1：pET32a质粒的双酶切产物；2：pET32a-S-1质粒的双酶切产物；3：pET32a-S2-1质粒的双酶切产物；4：pET32a-COE质粒的双酶切产物M：DL10000DNAMarker；1：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a；2：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a-S-1；3：Dou-blerestrictiveenzymedigestionofpET32a-S2-1；4：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a-COE图1PCR扩增结果Fig.1PCRproductofgeneM：DNA分子质量标准；1：S-1（1184bp）；2：S2-1（439bp）；3：COE（433bp）M：DL2000DNAMarker；1：S-1（1184bp）；2：S2-1（439bp）；3：COE（433bp）2.4ELISA检测同时检测免前血清、一免后第7天的血清、二免后第7天的血清、三免后第7天的血清及三免后第14天的血清中的IgG抗体水平。结果见图5所示。IgG水平随免疫次数的增加而显著升高，4组间差异不显著。2.5Western-blot检测将各蛋白的超免疫血清与其进行Western-blot检测，结果（见图6）发现，出现特异性目的条带，证明这3个蛋白均能与其各?
【作者单位】：上海市农业科学院畜牧兽医研究所;上海海洋大学水产与生命学院;上海市农业遗传育种重点实验室;
【基金】：沪农科攻字(2013)第3-6项目;沪农科攻字(2013)第5-5号项目;沪农科产字(2016)第6号项目;沪农科推字(2017)第1-11号沪农青2016第1-35号项目
【分类号】：S852.651

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