抗贝氏隐孢子虫卵黄抗体的制备与鉴定

发布时间：2019-07-24 06:19

【摘要】：为分析抗贝氏隐孢子虫的免疫机制,本研究将纯化的贝氏隐孢子虫卵囊经处理后制备成免疫抗原,经鸡翅下及大腿内侧肌肉多点注射免疫6次150日龄产蛋海兰鸡,每次免疫间隔为15~20 d,以制备特异性抗贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi)卵黄免疫球蛋白(IgY)。结果显示,初次免疫后第120天,IgY效价达到1∶25 600,经免疫荧光法鉴定可识别贝氏隐孢子虫卵囊。用间接ELISA和间接免疫荧光试验比较测定IgY抗体对贝氏隐孢子虫、牛安氏隐孢子虫、猪等孢球虫及猪弓形虫的抗原发现,得到的IgY抗体能特异性识别贝氏隐孢子虫。间接ELISA法测定不同温度、不同pH下IgY的活性发现,制备的IgY抗体具有较好的热稳定性和一定的耐酸、耐碱性。以上结果表明,贝氏隐孢子虫卵囊抗原免疫蛋鸡可制备高质量的特异性IgY抗体,这为进一步应用抗隐孢子虫特异性IgY抗体治疗与诊断隐孢子虫病奠定基础。
【图文】：

第7期崔朝辉等：抗贝氏隐孢子虫卵黄抗体的制备与鉴定图3IgY抗体与血清抗体水平动态监测Fig.3Time-dependentchangesinthetitersofIgYandan-tibodiesinserumofimmunedchicken图1IgY纯化的SDS-PAGE分析Fig.1SDS-PAGEanalysisofthepurifiedIgYM：蛋白分子质量标准；1～2：粗提纯IgY；3～4：未提纯IgY；5～6：已纯化的IgYM：ProteinMarker；1-2：IncompletelypurifiedIgY；3-4：UnpurifiedIgY；5-6：PurifiedIgY虫、猪源弓形虫等原虫的可溶性蛋白抗原包被96孔酶标板。同时设贝氏隐孢子虫可溶性蛋白抗原作为阳性对照，用免疫鸡的抗贝氏隐孢子虫卵黄液作为一抗经倍比稀释，用上述ELISA方法测定效价，比较IgY的特异性。1.8间接免疫荧光试验（IFA）测定IgY的特异性参照1.7制备的荧光抗体染色标本步骤，用牛安氏隐孢子虫（C.andersoni）载玻片固定制作荧光染色标本，与贝氏隐孢子虫同步进行IgY的特异性测定，用上述免疫后纯化好的IgY进行间接免疫荧光试验，并用免疫前的IgY作为阴性对照，荧光显微镜下观察结果。1.9热稳定性试验将IgY稀释成1mg/mL，，各别取0.5mL，分别放入25、37、45、55、65、70、75和80℃水浴中加热15min后，立即放入冰水混合物中冷却，用ELISA测定各处理样品的效价。1.10耐酸碱性试验分别用pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的PBS缓冲液（0.01mol/L，pH7.4）将IgY抗体稀释为0.5mg/mL，并调至相对应的pH值，置37℃恒温箱孵育2h，然后用NaOH和HCl再分别将样品的pH值调至7.2～7.4，用ELISA测定抗体样品的效价。2结果2.1纯化后IgY浓度的测定将收集的初次免疫后第120～150天的卵黄抗体经提娶盐析、透析等纯化后，用Bradford法测得IgY的质量浓度为9.44mg/mL。2.2IgY的SDS-PAGE和间接免疫荧光分析?

第7期崔朝辉等：抗贝氏隐孢子虫卵黄抗体的制备与鉴定图3IgY抗体与血清抗体水平动态监测Fig.3Time-dependentchangesinthetitersofIgYandan-tibodiesinserumofimmunedchicken图1IgY纯化的SDS-PAGE分析Fig.1SDS-PAGEanalysisofthepurifiedIgYM：蛋白分子质量标准；1～2：粗提纯IgY；3～4：未提纯IgY；5～6：已纯化的IgYM：ProteinMarker；1-2：IncompletelypurifiedIgY；3-4：UnpurifiedIgY；5-6：PurifiedIgY虫、猪源弓形虫等原虫的可溶性蛋白抗原包被96孔酶标板。同时设贝氏隐孢子虫可溶性蛋白抗原作为阳性对照，用免疫鸡的抗贝氏隐孢子虫卵黄液作为一抗经倍比稀释，用上述ELISA方法测定效价，比较IgY的特异性。1.8间接免疫荧光试验（IFA）测定IgY的特异性参照1.7制备的荧光抗体染色标本步骤，用牛安氏隐孢子虫（C.andersoni）载玻片固定制作荧光染色标本，与贝氏隐孢子虫同步进行IgY的特异性测定，用上述免疫后纯化好的IgY进行间接免疫荧光试验，并用免疫前的IgY作为阴性对照，荧光显微镜下观察结果。1.9热稳定性试验将IgY稀释成1mg/mL，各别取0.5mL，分别放入25、37、45、55、65、70、75和80℃水浴中加热15min后，立即放入冰水混合物中冷却，用ELISA测定各处理样品的效价。1.10耐酸碱性试验分别用pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的PBS缓冲液（0.01mol/L，pH7.4）将IgY抗体稀释为0.5mg/mL，并调至相对应的pH值，置37℃恒温箱孵育2h，然后用NaOH和HCl再分别将样品的pH值调至7.2～7.4，用ELISA测定抗体样品的效价。2结果2.1纯化后IgY浓度的测定将收集的初次免疫后第120～150天的卵黄抗体经提娶盐析、透析等纯化后，用Bradford法测得IgY的质量浓度为9.44mg/mL。2.2IgY的SDS-PAGE和间接免疫荧光分析?
【作者单位】： 河南农业大学牧医工程学院河南省人兽共患病国际联合实验室;
【基金】：河南省科技创新杰出人才计划项目(34200510012) 十二五国家科技重大专项(2012ZX10004220-011)
【分类号】：S852.723

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 周春香;蔡进忠;李春花;张龙现;何国声;;牦牛隐孢子虫(Cryptospordiun in Yak)研究进展[J];青海畜牧兽医杂志;2009年06期

2 彭昊;李军;陶立;陈泽祥;韦志锋;许力干;杨威;;牛隐孢子虫多重PCR方法的建立及应用[J];中国人兽共患病学报;2012年08期

3 张冰;张杰;许杰;何惠君;巴图艾德尼;;隐孢子虫检测方法研究进展[J];中国草食动物科学;2014年02期

4 何宏轩 ,张晓龙;CP15-DNA免疫母畜对幼畜抗微小隐孢子虫感染的保护性研究[J];国外医学(寄生虫病分册);2000年03期

5 章达明,黄锦光;广州市猪牛感染隐孢子虫调查[J];中国人兽共患病杂志;2001年02期

6 杨丽君,禹滨,杨武雄;种鸡感染隐孢子虫的鉴定[J];中国兽医寄生虫病;2001年04期

7 王权,周金林,钱应娟,陈永军,张惠英,周勇志,王永康,徐新红;套式PCR检测奶牛粪便中隐孢子虫[J];畜牧兽医学报;2002年06期

8 胡俊杰,左仰贤;家畜禽隐孢子虫研究简况[J];畜牧兽医科技信息;2002年05期

9 孙铭飞,张龙现,宁长申,闫文朝,王进产,李慧琴;禽类隐孢子虫研究进展[J];中国人兽共患病杂志;2005年06期

10 武林,李培英;隐孢子虫致病机理的研究进展[J];中国兽医寄生虫病;2005年03期

相关会议论文 前10条

1 彭昊;李军;陶立;陈泽祥;唐林生;韦志锋;马春霞;谢宇舟;yば郾

本文编号：2518444