抗冻蛋白对山羊精子冷冻保护效果的分析

发布时间：2019-07-24 06:19

【摘要】：本实验系统评价了抗冻蛋白Ⅲ(AFPⅢ)对山羊精子的冷冻保护效果。采用假阴道法采集6只云南黑山羊精液,离心洗涤去除精浆后和冷冻稀释液(0、0.1、1、10、100μg/m L AFPⅢ)混合,经4℃平衡、液氮气相预冻后直接投入液氮保存。解冻后检测精子活力、顶体、质膜以及早期凋亡等指标。同时采用透射电镜(TEM)观察冷冻对精子超微结构的影响。结果表明:与对照组相比,AFPⅢ并不能显著改善山羊解冻后精子活力、顶体完整性、质膜完整性和低渗耐受性(P0.05)。此外,AFPⅢ并不能抑制解冻后精子的磷脂酰丝氨酸(PS)外翻。电镜实验结果进一步证实,AFPⅢ并不能有效保护冷冻精子质膜。总之,本实验证实,AFPⅢ并不能降低山羊精子的冷冻损伤,相反其可能加重冷冻对精子质膜的损伤,其损伤机制尚需要进一步研究。
【图文】：

AFPⅢ对山羊冷冻精子超微结构的影响

彡鼻暗纳窖蚨尘鄵谱鞒绦颉?本实验结果表明，在冷冻稀释液中添加AFPⅢ并不能降低冷冻对山羊精子活力和顶体的损伤；而且随着抗冻蛋白浓度的增加，解冻后精子的活力呈逐步加重的趋势。然而国外的一些研究表明，AFP可以对哺乳动物精子提供一定的冷冻保护作用。例如，AFPⅢ可以提高灵长类动物精子解冻后的活力[11]。此外，AFP能够提高绵羊冷冻精子的顶体完整性[8]。造成实验结果差异的原因可能是由于动物种类不同或采用的AFP产品不同。然而，争议性的结果仍然存在。在小鼠上，Koshimoto等[10]得出了与本研究图5AFPⅢ对山羊冷冻精子超微结构的影响A和B：冷冻对精子质膜和顶体的影响；C：不含AFPⅢ冷冻组精子的超微结构；D：AFPⅢ冷冻组（10μg/mL）精子的超微结构类似的结论。开始他们认为AFP可以抑制重结晶从而缓解精子细胞的冷冻损伤。然而，结果发现，不同浓度（1~100μg/mL）的AFPI、AFPⅢ或抗冻糖蛋白并不能有效地保护小鼠冷冻精子；相反，随着AFP浓度的升高，解冻后小鼠精子的存活率呈逐步下降的趋势。此外，本研究发现AFPⅢ无法降低冷冻解冻过程对山羊精子质膜的损伤。TEM实验结果也证实了这个结论。解冻后精子质膜完整率随着AFPⅢ浓度的升高呈逐步下降的趋势。此外，AFPⅢ也不能抑制冷冻解冻过程导致的质膜PS外翻。众所周知，PS外翻是细胞早期凋亡的一个重要标志，这表明AFPⅢ不能防止冷冻精子的早期凋亡。随着AFPⅢ浓度的升高，解冻后精子的PS标记率呈逐步增加的趋势，当AFPⅢ浓度提高至1%时，其PS标记率在60%以上，而且大部分是晚期凋亡细胞，这从另一个侧面反映了冷冻严重破坏了精子质膜的完整性。HOST实验结果表明，AFPⅢ并不能提高山羊冷冻精子的低渗耐受性。根据目前的报道，精子的低渗耐受性和其受?

流式分析散点图显示，解冻后

-55-2017年第53卷第3期ScienceandTechnology·科学技术的顶体完整性。最右侧亚群代表顶体完整性最好的精子群，而其他2个亚群代表顶体部分完整的精子细胞群。随着AFPⅢ浓度的增加，冷冻精子的顶体完整基本维持在58%左右，而且各处理组之间差异不显著（P>0.05）。AFPⅢ对冷冻精子质膜和磷脂酰丝氨酸（PS）分布的影响见图3。流式分析散点图显示，解冻后精子经AnnexinV-FITC和碘化丙啶（PI）双标后分为4个细胞亚群。左下角细胞群代表正常精子（AnnexinV和PI均阴性）；右下角细胞群代表早期凋亡细胞群（AnnexinV阳性，PI阴性）；左上角细胞群代表坏死细胞（AnnexinV阴性，PI阳性）；右上角细胞群代表晚期凋亡细胞（AnnexinV和PI阳性）。图3A表明，随着AFPⅢ浓度的升高，精子的质膜完整性呈逐步下降的趋势。当冷冻稀释液中不含AFPⅢ时，其质膜完整率为（49.51±6.53）%。当AFPⅢ浓度提高至0.1μg/mL时，其质膜完整率骤降至（38.42±8.49）%，显著低于不加AFPⅢ处理组（P<0.05）。当AFPⅢ浓度为10μg/mL时，解冻后精子质膜完整率仅为20%左右，与不加AFPⅢ组差异极显著（P<0.01）。此外，AFPⅢ并不能防止冷冻导致的精子质膜PS外翻。如图3B所示，当AFPⅢ浓度为0.1μg/mL时，精子PS标记率显著高于不添加AFPⅢ冷冻组（53.19%vs42.71%，，P<0.05）。当AFPⅢ浓度进一步提高至10μg/mL时，其PS标记率在60%以上，与不加AFPIII冷冻组差异极显著（P<0.01）。AFPⅢ对山羊冷冻精子低渗耐受性的影响见图4。随着抗冻蛋白浓度的升高，解冻后精子低渗耐受性呈逐步下降的趋势。当AFPⅢ浓度为1μg/mL时，精子弯尾率为（30.38±7.45）%，显著低于不加AFPⅢ冷冻组精子（P<0.05）。当AFPⅢ浓度进一步提高至10μg/mL时，解冻后精子弯尾率仅为25%左右?
【作者单位】：云南省畜禽遗传资源保护和种质创新工程实验室云南省肉羊工程技术研究中心云南省畜牧兽医科学院;鲁甸县畜牧兽医局;
【基金】：国家自然科学基金(31360551、31560635) 云南省应用基础研究计划项目(2016FB042) 云南省中青年学术技术带头人培养计划(2014HB051) 云南省科技计划项目(2014BB014) 云南省高新技术产业发展项目计划(201404) 家养动物种质资源平台
【分类号】：S827

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