猪病毒性腹泻病原ELISA及Luminex检测方法研究

发布时间：2019-07-25 18:11

【摘要】：引起猪腹泻的病毒性病原主要有猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis virus,TGEV)和轮状病毒(Porcine rotavirus,PRV)),其中PEDV与TGEV同属于冠状病毒科,是最重要的两种病原,引起发病猪严重腹泻、呕吐和脱水,各年龄的猪均都可感染,死亡率可高达100%。我国大部分省市地区都有这两种病发生的报道,临床上常呈混合感染,或继发感染,给养猪业造成了重大损失。目前实验室诊断方法以病毒分离鉴定、PCR扩增技术为主。病毒分离周期长,且难度大;而PCR检测存在一定比例的假阳性。本研究利用生物素-亲和素具有高亲和性的特性,将PEDV和TGEV Ig G抗体分别进行生物素标记,并以商品化PEDV S蛋白单克隆抗体和TGEV S蛋白单克隆抗体作为捕获抗体,分别建立了检测PEDV、TGEV的生物素-亲和素系统双抗体夹心ELISA检测方法,并初步建立单一病原检测的Luminex体系,为后续猪腹泻病原的多重检测方法研究奠定基础。1.PEDV双抗体夹心ELISA检测方法的建立以体外表达的PEDV S蛋白作为抗原,商品化抗PEDV S蛋白单克隆抗体作为捕获抗体,生物素标记的抗PEDV Ig G作为检测抗体,建立了PEDV生物素-亲和素系统双抗夹心ELISA方法。结果表明,该方法可以检测到PEDV S蛋白的最低检测限量为20 ng/ul,且稳定性和特异性较好。利用该方法对采集的25份临床猪腹泻样品进行检测,结果检出3份PEDV阳性样品,与RT-PCR检测方法的符合率为100%。2.TGEV双抗体夹心ELISA检测方法的建立以商品化的TGEV S蛋白单克隆抗体作为捕获抗体,纯化的TGEV细胞毒作为抗原,生物素标记的抗TGEV Ig G作为检测抗体,建立了检测TGEV的生物素-亲和素系统双抗夹心ELISA方法。结果表明,该方法可检测TGEV细胞毒的最低浓度为17.5 ng/μl,敏感性较好。此外,利用该方法对采集的25份临床猪腹泻样品进行检测,结果检出1份TGEV阳性样品,与RT-PCR检测方法的符合率为100%。3.PEDV、TGEV Luminex方法初步建立应用xMAP液相芯片技术原理,以建立的双抗夹心反应条件为参照,用偶联微球的商品化单克隆抗体和生物素化Ig G抗体,初步建立了捕获PEDV、TGEV病原的Liqui Chip液相蛋白芯片检测方法。本研究成功建立了PEDV和TGEV的生物素-亲和素系统双抗夹心ELISA检测方法,且可用于临床样品的筛检。同时对Luminex检测方法进行初步研究,为建立猪腹泻多病原检测系统奠定了基础。
【图文】：

目前该技术常用于核酸、蛋白等大分子的检测，以及酶学，受体和配体，，号通路等方面的研究。Pickering[56]等建立了检测肺炎球菌多糖疫苗抗体的液相测技术，Steven Lawson等[57]应用该技术建立了可同时检测8种猪细胞因子的液相蛋白测方法。该方法的原理图如下[58]：

猪病毒性腹泻病原ELISA及Luminex检测方法研究

SDS-PAGE检测抗PEDVIgG纯化效果
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28

【参考文献】