拉沙里菌素单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立

发布时间：2019-08-17 20:24

【摘要】：拉沙里菌素(lasalocid,LAS)是由拉沙里链霉菌发酵产生的一种聚醚类离子载体抗生素,主要用于提高反刍动物饲料利用率和预防畜禽球虫感染。但在实际生产中,由于LAS不合理使用,导致其在牛奶、鸡蛋及动物组织中残留超标,严重威胁人类的健康。目前,检测LAS残留的方法主要是高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法。然而这些传统的仪器检测不但需要昂贵的仪器设备和复杂的前处理,而且还需要专业的技术人员操作,这些因素都影响着样品检测的效率和准确度。ELISA检测法是免疫学方法的一种,基于抗原抗体特异性结合的原理,具有高特异性和高灵敏性的特点,由于其检测方法简单、快速、高效且便于携带,所以适合大批量样品的快速检测。本实验采用活性酯法合成LAS完全抗原,经透析、鉴定后免疫BALB/c小鼠,然后利用单克隆抗体技术、酶联免疫吸附技术及小鼠体内诱生腹水技术,制备出针对LAS的效价高、特异性强的抗体,并以此为基础建立间接竞争ELISA工作方法。1、LAS完全抗原的合成与鉴定LAS属于半抗原,分子中含有羟基,采用活性酯法将分子中的羧基先与间隔臂分子中的氨基连接,形成稳定的酰胺键,然后再与载体蛋白(BSA、OVA)进行偶联,使半抗原与载体蛋白之间形成一间隔臂。完全抗原经过SDS-PAGE法、紫外扫描法和免疫学方法鉴定,结果表明LAS与载体蛋白偶联成功。采用BCA试剂盒测得LAS-BSA和LAS-OVA蛋白浓度分别为2.54 mg/mL和2.42 mg/mL。2、LAS单克隆抗体的制备以LAS-BSA为免疫原,免疫BALB/c小鼠,五免后小鼠血清效价在1:12800。采用杂交瘤技术进行脾细胞和骨髓瘤细胞的融合,采用ELISA法和有限稀释法筛选出一株可稳定分泌针对LAS的抗体的单克隆细胞株C11,采用小鼠体内诱生法制备了 20mL腹水,其蛋白浓度为33.39mg/mL。交叉实验结果显示,与莫能菌素钠、盐霉素钠、马杜霉素胺、头孢噻吩钠和硫酸链霉素均无交叉反应。3、ELISA检测方法的建立选用C11株单克隆细胞,采用小鼠体内诱生法制备单克隆抗体,建立检测LAS的间接竞争ELISA法。包被原和腹水的最佳工作浓度分别是1:400和1:4000,LAS浓度在5～1000 ng/mL 时,线性关系良好,线性方程为 y = 0.376x-0.2374(R2 = 0.9914),IC50 为 90.22 ng/mL,LOD 为 6.04 ng/mL。4、牛奶中LAS添加回收实验将牛奶样品进行前处理,结果显示样品处理后再用PBS稀释8倍时可基本消除基质干扰。LAS浓度在10～1000 ng/mL时,标准曲线线性关系良好,线性方程为y = 0.4111x-0.3591(R2 = 0.9912),IC50为 121.96ng/mL,LOD 为 13.59ng/mL。用 50、500、800ng/mL的LAS标准溶液做回收实验,回收率在81.76%～102.41%之间。
【图文】：

化学结构式

１．１逦ＬＡＳ理化性质逡逑ＬＡＳ是一种无色或白色结晶性粉末，分子式为Ｃ３４Ｈ５４0８，分子量为５９０．７８，熔点逡逑１１ＣＴＣ？１１４°ＣＷ。微溶于水，可溶于大部分有机溶剂，化学结构式如图１所示。其钠盐性逡逑能稳定，３７°Ｃ下可保存６个月不变，２５°Ｃ下保存１２月不变，含量仍维持在９５％以上［９］。逡逑0ｈ３邋ｃｈＨ３３％Ｈ３？逡逑ｈ0邋丫逡逑ｈｃＡ＾邋ｏｈ邋0逦）逡逑Ｍ３ｕ逦Ｈ３Ｃ逡逑图１邋ＬＡＳ化学结构式逡逑Ｆｉｇ邋１邋Ｔｈｅ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＬＡＳ逡逑１．２逦ＬＡＳ作用机理逡逑ＬＡＳ是一种具有高亲脂性的物质％，分子中含有两个醚环和一个一元有机酸，，在溶液逡逑中分子两端由氢键连接形成特殊环状构型，分子中的羟氧、醚氧、羧酸氧基团中的氧原子逡逑组成了一个能捕获阳离子的空洞［１（）］，分子的外部由烃类构成，具有疏水性［６，１１］。该构型分子逡逑可以与Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋等一价或二价阳离子结合，形成一种脂溶性复合物而通过生物膜，逡逑从而发挥药理作用［１２＿１４］。逡逑

示意图,示意图,透析袋,液体转移

乙液：取３．５邋ｍｇ邋ＢＳＡ溶于６００叫ＣＢＳ中。逡逑将上述甲液沿管壁缓慢加入乙液中，边加边摇匀，之后３７°Ｃ搅拌过夜，具体反应过程逡逑见图２。将反应后的液体转移至处理好的透析袋内，两端用透析袋夹密封后置于１邋ＬＰＢＳ溶逡逑液中４°Ｃ搅拌透析３ｄ，每天更换３次透析液，最后将透析袋内液体分装冻存。逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S859.84

【参考文献】