犬副流感病毒单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立

发布时间：2019-08-19 09:20

【摘要】：犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)首次于1967年从患呼吸道疾病的犬中分离获得,是犬窝咳的主要病因之一。临床表现为咳嗽、流鼻涕等呼吸道症状。当与细菌、病毒等混合感染时,可引起犬的死亡。血清学调查表明CPIV在世界各国普遍流行。现有的关于CPIV流行病学调查资料显示,在犬以及其他野生动物的血清样品中,CPIV的阳性率较高。由于CPIV长期困扰着养犬业的健康发展,所以需要一种准确、简便的诊断方法来对该病作出准确诊断。CPIV的NP蛋白是核衣壳蛋白的主要成分,与病毒RNA直接结合,高度保守,在病毒感染时可引起强烈的抗体反应。通过RT-PCR扩增NP基因,并将NP基因克隆到p ET-30a载体,然后转化至E.coli BL21感受态细胞,构建重组质粒pET-30a-NP,并对重组质粒进行双酶切和测序鉴定。利用IPTG对重组菌株进行诱导表达,获得重组蛋白NP。对重组蛋白NP进行纯化鉴定,SDS-PAGE的试验结果显示,重组蛋白NP的分子量与预期大小相符;Western blot的试验结果显示,重组蛋白NP能与CPIV阳性血清发生反应。使用纯化的重组NP蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,将SP2/0细胞与经过免疫鼠的脾细胞进行细胞融合。用CPIV作为包被抗原,建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,经过筛选得到3株阳性杂交瘤细胞株,能稳定分泌单克隆抗体,命名为2F1、3B9、4D11。Western blot试验和间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,3株阳性杂交瘤细胞上清均可以同CPIV发生特异性反应。将4D11杂交细胞株腹腔注射小鼠,获取腹水,测得腹水效价为1:104。本研究以CPIV作为检测抗原,以4D11单克隆抗体作为竞争抗体,建立竞争ELISA检测方法并且对试验条件进行优化,确定试验的最佳反应条件。利用已建立的竞争ELISA检测方法检测77份CPIV犬阳性血清,根据统计学方法计算得到阳性临界值为15.1%。该方法与犬细小病毒(CPV)血清、犬瘟热病毒(CDV)血清无交叉反应,表明该检测方法具有良好的特异性;批内重复试验的变异系数为1.30%~5.29%,批间变异系数为1.18%~8.55%,表明该检测方法具有较好的重复性。分别使用建立的竞争ELISA方法和血凝抑制试验对153份血清进行检测,结果显示符合率为92.16%。本实验建立了CPIV抗体的竞争ELSA检测方法,优化了试验条件,为CPIV的快速诊断、流行病学的调查与免疫抗体监测提供了技术支持。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4

【参考文献】

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本文编号：2528159