獭兔肠黏膜乳杆菌的分离鉴定及其体外益生特性研究

发布时间：2019-11-05 12:47

【摘要】：【目的】分离筛选适于在獭兔肠道中存活并定殖的高黏附性乳酸菌株。【方法】通过乳酸菌选择性培养基从5和10日龄哺乳獭兔肠黏膜中分离具有抑制大肠杆菌活性的菌株,经16SrRNA基因序列分析进行鉴定,并检测其耐人工胃液、耐胆盐及黏附特性、表面疏水性等益生特性。【结果】分离筛选出3株具有较强抑制大肠杆菌活性的菌株,分别鉴定为短乳杆菌(L1)、植物乳杆菌(L2)、干酪乳杆菌(L3),其抑菌活性大小为L3L2L1。3株菌株均能耐受pH=4.0的人工胃液;在pH=3.0人工胃液中,L2和L3的活菌含量未出现明显变化(P0.05),而L1的活菌含量显著下降(P0.05);3株菌株在pH=2.0和pH=1.8人工胃液中的活菌含量均显著降低(P0.01)。L1和L2均能耐受2.0g/L胆盐;虽然L1和L2在3.0g/L胆盐中的活菌量出现极显著(P0.01)和显著(P0.05)下降,但二者仍保留较高活菌含量;胆盐对L3的存活有明显抑制作用,随着胆盐含量的升高,L3的活菌含量极显著降低(P0.01)。L2和L3对黏蛋白的黏附率无显著差异(P0.05),均显著高于L1(P0.05)。L3的表面疏水性最高,L2次之,二者之间无显著差异(P0.05);L1的表面疏水性低于L2(P=0.092),显著低于L3(P0.05)。【结论】分离所获得的3株乳杆菌均具备益生菌特性,其中以植物乳杆菌L2最佳。
【图文】：

℃３０ｓ，５５℃９０ｓ，７２℃３０ｓ，３５个循环；７２℃２ｍｉｎ；４℃保存。试验设空白对照，以ｄｄＨ２Ｏ代替模板进行扩增。ＰＣＲ扩增产物经１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳检测后，用Ａｘｙｇｅｎ核酸纯化试剂盒纯化回收，送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。将１６ＳｒＲＮＡ基因测序结果提交到ＧｅｎＢａｎｋ，使用Ｂｌａｓｔ程序与ＧｅｎＢａｎｋ数据库中的乳酸菌１６ＳｒＲＮＡ序列进行同源性比较和菌种鉴定。用ＭＥＧＡ５．１０软件分析所测菌株序列和其他与乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）同源性较高菌种的１６ＳｒＲＮＡ基因序列，构建系统发育树。１．５分离菌株对人工胃液和胆盐的耐受性检测分离菌株的人工胃液（ＳＥＳ）耐受性检测参考Ｇａｒｃíａ－Ｒｕｉｚ等［１０］的方法进行。取细菌含量为１０８～１０９ＣＦＵ／ｍＬ的各菌株新鲜悬浮液与含６ｇ／Ｌ胃蛋白酶的无菌电解质溶液（０．４４ｇ／ＬＣａＣｌ２，１２．４ｇ／ＬＮａＣｌ，４．４ｇ／ＬＫＣｌ，，２．４ｇ／ＬＮａＨＣＯ３）等体积混合。为模拟菌株从食管入胃的环境特点，各菌株每培养２０ｍｉｎ后立即用１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ调整混合培养液的ｐＨ值，由起始ｐＨ＝６．２逐步降低为５．０，４．０，３．０，２．０；最后调整混合培养液ｐＨ值为１．８，培养３０ｍｉｎ。分别在培养２０，４０，６０，８０，１００和１３０ｍｉｎ采集各菌株培养液，用平板计数法测定各菌株在连续不同ｐＨ值培养条件下的活菌含量。将各分离菌株的新鲜悬浮液（菌含量为１０

℃３０ｓ，５５℃９０ｓ，７２℃３０ｓ，３５个循环；７２℃２ｍｉｎ；４℃保存。试验设空白对照，以ｄｄＨ２Ｏ代替模板进行扩增。ＰＣＲ扩增产物经１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳检测后，用Ａｘｙｇｅｎ核酸纯化试剂盒纯化回收，送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。将１６ＳｒＲＮＡ基因测序结果提交到ＧｅｎＢａｎｋ，使用Ｂｌａｓｔ程序与ＧｅｎＢａｎｋ数据库中的乳酸菌１６ＳｒＲＮＡ序列进行同源性比较和菌种鉴定。用ＭＥＧＡ５．１０软件分析所测菌株序列和其他与乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）同源性较高菌种的１６ＳｒＲＮＡ基因序列，构建系统发育树。１．５分离菌株对人工胃液和胆盐的耐受性检测分离菌株的人工胃液（ＳＥＳ）耐受性检测参考Ｇａｒｃíａ－Ｒｕｉｚ等［１０］的方法进行。取细菌含量为１０８～１０９ＣＦＵ／ｍＬ的各菌株新鲜悬浮液与含６ｇ／Ｌ胃蛋白酶的无菌电解质溶液（０．４４ｇ／ＬＣａＣｌ２，１２．４ｇ／ＬＮａＣｌ，４．４ｇ／ＬＫＣｌ，２．４ｇ／ＬＮａＨＣＯ３）等体积混合。为模拟菌株从食管入胃的环境特点，各菌株每培养２０ｍｉｎ后立即用１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ调整混合培养液的ｐＨ值，由起始ｐＨ＝６．２逐步降低为５．０，４．０，３．０，２．０；最后调整混合培养液ｐＨ值为１．８，培养３０ｍｉｎ。分别在培养２０，４０，６０，８０，１００和１３０ｍｉｎ采集各菌株培养液，用平板计数法测定各菌株在连续不同ｐＨ值培养条件下的活菌含量。将各分离菌株的新鲜悬浮液（菌含量为１０


本文编号：2556186