白消安消减鹅胚内源性原始生殖细胞
发布时间：2019-11-08 18:39
【摘要】：降低胚胎内源性原始生殖细胞是提高禽类生殖嵌合体效率的最有效途径,本试验首次研究白消安对鹅胚内源性原始生殖细胞的消减作用。将白消安乳化剂直接注射到鹅种蛋的卵黄内,待鹅胚发育到第8 d时分离生殖腺中的PGCs,并统计PGCs数目。结果显示,糖原染色与免疫荧光染色充分证明从鹅胚生殖腺中成功分离到PGCs;较低浓度(每1颗卵注射150μg)的白消安能显著降低鹅胚内源性原始生殖细胞,从对照的单胚约1 200个PGCs降低到处理组的80个左右。鹅相对于鸡而言对白消安更敏感,较低浓度即可显著降低鹅内源性PGCs。
【图文】：
豢?∶100稀释，4℃过夜孵育，PBS-T清洗后，二抗1∶1000稀释，37℃避光孵育1h，将Hoechst33342用PBS稀释1000倍至10μg/ml，加入到PGCs中，避光染色2min，倒置荧光显微镜下观察细胞。1．5数据分析每个处理采集15个鹅胚的数据，采用SPSS11．0中ANOVA进行相关统计学分析，显著性差异以P＜0.05为标准。统计作图采用SigmaPlot绘图软件。2结果2．1鹅胚PGCs的形态观察将每只鹅胚分离的左右两侧生殖腺进行胰酶-EDTA消化，放到24孔培养板体外培养4h，收集培养液，于显微镜下进行观察。可见刚消化后的细胞中杂细胞很多(图1A)，体外培养4h后大多数杂细胞贴壁(图1B)，而鹅胚PGCs不贴壁，由此将鹅胚PGCs与其他细胞分离开来。从图1中可以看出鹅胚PGCs呈圆形或椭圆形，直径约为15～25μm，体积比体细胞大，比红细胞大2倍左右，细胞核为圆形，分布在稍偏中心位置，细胞另一侧有颜色较浅的脂滴，细胞表现出典型的原始生殖细胞特点。2．2鹅胚PGCs的鉴定采用糖原染色法和免疫荧光染色法对鹅胚生殖腺中分离的PGCs进行鉴定，结果表明，从鹅胚生殖腺中成功分离到PGCs。糖原染色如图2所示，深紫色的为PGCs，而其他细胞呈淡蓝色，形成明显的着色差异。抗原抗体染色是利用PGCs特异表达Vasa蛋白，将抗Vasa的多克隆抗体anti-DDX4(一抗)处理分离的细胞，再用Cy3标记的二抗(红色荧光)处理后于荧光显微镜下观察，如图3所示，PGCs细胞除细胞核A:鹅胚生殖腺经胰酶-EDTA消化成单个细胞;B:混合细胞体外培养4h;箭头所示为鹅胚PGCs。图1鹅生殖腺中分离出的PGCsFig．1Primordialgermcells(PGCs)isolatedfromgoosego-nads为蓝色外，细胞膜周围呈红色荧光，而其他类型的细胞只有细胞核为蓝色，细胞膜周围无红色荧光。由此可见，分离出的细胞中存在一定比?
狷?养液，于显微镜下进行观察。可见刚消化后的细胞中杂细胞很多(图1A)，体外培养4h后大多数杂细胞贴壁(图1B)，而鹅胚PGCs不贴壁，由此将鹅胚PGCs与其他细胞分离开来。从图1中可以看出鹅胚PGCs呈圆形或椭圆形，直径约为15～25μm，体积比体细胞大，比红细胞大2倍左右，细胞核为圆形，分布在稍偏中心位置，细胞另一侧有颜色较浅的脂滴，细胞表现出典型的原始生殖细胞特点。2．2鹅胚PGCs的鉴定采用糖原染色法和免疫荧光染色法对鹅胚生殖腺中分离的PGCs进行鉴定，结果表明，从鹅胚生殖腺中成功分离到PGCs。糖原染色如图2所示，深紫色的为PGCs，而其他细胞呈淡蓝色，形成明显的着色差异。抗原抗体染色是利用PGCs特异表达Vasa蛋白，将抗Vasa的多克隆抗体anti-DDX4(一抗)处理分离的细胞，再用Cy3标记的二抗(红色荧光)处理后于荧光显微镜下观察，如图3所示，PGCs细胞除细胞核A:鹅胚生殖腺经胰酶-EDTA消化成单个细胞;B:混合细胞体外培养4h;箭头所示为鹅胚PGCs。图1鹅生殖腺中分离出的PGCsFig．1Primordialgermcells(PGCs)isolatedfromgoosego-nads为蓝色外，细胞膜周围呈红色荧光，，而其他类型的细胞只有细胞核为蓝色，细胞膜周围无红色荧光。由此可见，分离出的细胞中存在一定比例的PGCs。箭头所示为阳性着色的PGCs。图2鹅胚原始生殖细胞的糖原染色Fig．2Periodicacid-schiffstaining(PAS)ofgoosePGCsA:特异免疫荧光染色后PGCs呈红色荧光;B:Hoechst33342染色后PGCs呈蓝色荧光;C:B与A的叠加图;D:明场下PGCs。图3鹅胚原始生殖细胞的免疫荧光染色Fig．3TheimmunofluorescencestainingofPGCs于建宁等:白消安消减鹅胚内源性原始生殖细胞865
本文编号：2557984
【图文】：
豢?∶100稀释，4℃过夜孵育，PBS-T清洗后，二抗1∶1000稀释，37℃避光孵育1h，将Hoechst33342用PBS稀释1000倍至10μg/ml，加入到PGCs中，避光染色2min，倒置荧光显微镜下观察细胞。1．5数据分析每个处理采集15个鹅胚的数据，采用SPSS11．0中ANOVA进行相关统计学分析，显著性差异以P＜0.05为标准。统计作图采用SigmaPlot绘图软件。2结果2．1鹅胚PGCs的形态观察将每只鹅胚分离的左右两侧生殖腺进行胰酶-EDTA消化，放到24孔培养板体外培养4h，收集培养液，于显微镜下进行观察。可见刚消化后的细胞中杂细胞很多(图1A)，体外培养4h后大多数杂细胞贴壁(图1B)，而鹅胚PGCs不贴壁，由此将鹅胚PGCs与其他细胞分离开来。从图1中可以看出鹅胚PGCs呈圆形或椭圆形，直径约为15～25μm，体积比体细胞大，比红细胞大2倍左右，细胞核为圆形，分布在稍偏中心位置，细胞另一侧有颜色较浅的脂滴，细胞表现出典型的原始生殖细胞特点。2．2鹅胚PGCs的鉴定采用糖原染色法和免疫荧光染色法对鹅胚生殖腺中分离的PGCs进行鉴定，结果表明，从鹅胚生殖腺中成功分离到PGCs。糖原染色如图2所示，深紫色的为PGCs，而其他细胞呈淡蓝色，形成明显的着色差异。抗原抗体染色是利用PGCs特异表达Vasa蛋白，将抗Vasa的多克隆抗体anti-DDX4(一抗)处理分离的细胞，再用Cy3标记的二抗(红色荧光)处理后于荧光显微镜下观察，如图3所示，PGCs细胞除细胞核A:鹅胚生殖腺经胰酶-EDTA消化成单个细胞;B:混合细胞体外培养4h;箭头所示为鹅胚PGCs。图1鹅生殖腺中分离出的PGCsFig．1Primordialgermcells(PGCs)isolatedfromgoosego-nads为蓝色外，细胞膜周围呈红色荧光，而其他类型的细胞只有细胞核为蓝色，细胞膜周围无红色荧光。由此可见，分离出的细胞中存在一定比?
狷?养液，于显微镜下进行观察。可见刚消化后的细胞中杂细胞很多(图1A)，体外培养4h后大多数杂细胞贴壁(图1B)，而鹅胚PGCs不贴壁，由此将鹅胚PGCs与其他细胞分离开来。从图1中可以看出鹅胚PGCs呈圆形或椭圆形，直径约为15～25μm，体积比体细胞大，比红细胞大2倍左右，细胞核为圆形，分布在稍偏中心位置，细胞另一侧有颜色较浅的脂滴，细胞表现出典型的原始生殖细胞特点。2．2鹅胚PGCs的鉴定采用糖原染色法和免疫荧光染色法对鹅胚生殖腺中分离的PGCs进行鉴定，结果表明，从鹅胚生殖腺中成功分离到PGCs。糖原染色如图2所示，深紫色的为PGCs，而其他细胞呈淡蓝色，形成明显的着色差异。抗原抗体染色是利用PGCs特异表达Vasa蛋白，将抗Vasa的多克隆抗体anti-DDX4(一抗)处理分离的细胞，再用Cy3标记的二抗(红色荧光)处理后于荧光显微镜下观察，如图3所示，PGCs细胞除细胞核A:鹅胚生殖腺经胰酶-EDTA消化成单个细胞;B:混合细胞体外培养4h;箭头所示为鹅胚PGCs。图1鹅生殖腺中分离出的PGCsFig．1Primordialgermcells(PGCs)isolatedfromgoosego-nads为蓝色外，细胞膜周围呈红色荧光，，而其他类型的细胞只有细胞核为蓝色，细胞膜周围无红色荧光。由此可见，分离出的细胞中存在一定比例的PGCs。箭头所示为阳性着色的PGCs。图2鹅胚原始生殖细胞的糖原染色Fig．2Periodicacid-schiffstaining(PAS)ofgoosePGCsA:特异免疫荧光染色后PGCs呈红色荧光;B:Hoechst33342染色后PGCs呈蓝色荧光;C:B与A的叠加图;D:明场下PGCs。图3鹅胚原始生殖细胞的免疫荧光染色Fig．3TheimmunofluorescencestainingofPGCs于建宁等:白消安消减鹅胚内源性原始生殖细胞865
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