一株A型口蹄疫流行毒株全序列的测定及其全长感染性克隆的构建

发布时间：2020-01-23 19:23

【摘要】：【目的】测定一株A型口蹄疫流行毒株的全基因组序列,并构建其全长感染性克隆。【方法】参照已公布的A型口蹄疫病毒序列设计引物,将分离的口蹄疫病毒株A/Sea-97/CHA/2014全基因组分为4个重叠的片段进行RT-PCR扩增,并对其进行序列测定与分析。利用酶切连接法将4个基因片段依次克隆至p Blue Script SKhdv载体中,构建该流行毒株的全长c DNA克隆p QAHN。pQAHN经NotⅠ线性化后转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞,拯救病毒。【结果】口蹄疫病毒全基因组序列测定结果表明该毒株基因组全长8 171 bp[不包括poly(C)区段和poly(A)尾巴],开放阅读框为6 996 bp,编码2 332个氨基酸,5′和3′非编码区分别为1 091 bp和95 bp。VP1系统发生树分析表明该毒株与A/GDMM/CHA/2013毒株亲缘关系最近,相似性为99.1%。线化全长质粒转染BSR/T7细胞68 h后可观察到典型的细胞病变。拯救病毒的间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明成功拯救出了具有感染性的FMDV。拯救病毒与亲本病毒的噬斑表型及生长曲线试验表明二者具有相似的生长表型和增殖能力。【结论】该研究为我国口蹄疫病原生态分布、分子流行病学调查以及A型FMD新型疫苗的研究提供了有益的材料。
【图文】：

1个同义突变作为分子标记(将基因组第3040位C突变为A)，将引入突变后的A3片段和重组质粒pSK-A12分别用XbaⅠ/BglⅡ双酶切消化后，，纯化回收相应的目的片段，连接、转化和筛选阳性克隆，得到重组质粒pSK-A123。最后用BglⅡ/NotⅠ分别消化重组质粒pSK-A123和pSK-A4，纯化回收相应的目的片段，连接、转化和筛选阳性克隆，得到含FMDVA/Sea-97/CHA/2014株全长cDNA的克隆pQAHN。酶切鉴定全长质粒pQAHN，并将鉴定正确的全长质粒送至上海桑尼有限公司进行测序验证。A/Sea-97/CHA/2014株基因组全长cDNA克隆的构建策略见图1。图1FMDVA/Sea-97/CHA/2014株全长cDNA克隆的构建策略Figure1SchematicdiagramofthestrategyforconstructionofFMDVA/Sea-97/CHA/2014full-lengthcDNAclone

2024微生物学通报Microbiol.China2016,Vol.43,No.9Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn编码一个2332个氨基酸组成的多聚蛋白，其基因组组成见表2。图2RT-PCR扩增A1、A2、A3、A4片段及A12片段的融合PCRFigure2RT-PCRamplificationofA1,A2,A3,A4fragmentsandFusionPCRamplificationA12fragments注：1：DL10001DNAmarker；2：A1的RT-PCR产物；3：A2的RT-PCR产物；4：A12的融合PCR产物；5：A3的RT-PCR产物；6：A4的RT-PCR产物.Note:1:DL10001DNAmarker;2:RT-PCRproductofA1;3:RT-PCRproductofA2;4:FusionPCRproductsofA12;5:RT-PCRproductofA3;6:RT-PCRproductofA4.利用分子生物学软件MegAlign对比分析A/Sea-97/CHA/2014株与其他A型FMDV参考毒株的VP1基因序列，并采用邻接法(Neighbour-Joining，NJ)绘制系统进化树(图3)。分析结果表明，该流行毒株属于亚洲拓扑型(Asiatoptype)东南亚97毒株(Sea-97strain)，其与A/GDMM/CHA/2013处于同一分支。核苷酸序列对比结果表明该流行毒株与A/HUBWH/CHA/2009、A/LAO/1/2006、A/LAO/6/2006和A/LAO/36/2003毒株相似性在90.6%92.5%，与我国历史毒株AF/72相似性为78.3%，与2013年流行毒株A/GDMM/CHA/2013相似性最高，高达99.1%。2.3全长质粒pQAHN的构建及鉴定将A/Sea-97/CHA/2014株全基因分4个相互重叠的片段进行RT-PCR扩增，然后将4个片段依次连接到pBlueScriptSKhdv载体上，得到含A/Sea-97/表2FMDVA/Sea-97/CHA/2014基因组结构Table2ThegenomeorganizationofFMDVA/Sea-97/CHA/2014基因组Genome5′-UTRLVP4VP2VP3VP12A2B2C3A3B3C3D3′-UTR核苷酸Nucleotide109160325565466363648447969459213639141095氨基酸Aminoacid2018521822121216149323153712

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