银杏外种皮多糖抑制新城疫病毒作用的研究

发布时间：2020-01-28 14:46

【摘要】：目的:为研究GBEP对NDV的作用,通过水提醇沉法提取银杏外种皮多糖(GBEP),采用苯酚-硫酸法测定GBEP的糖含量,并用傅里叶-红外光谱法分析其光谱特征。在此基础上将不同浓度GBEP接种DF-1细胞和9-11日龄鸡胚,以测定GBEP在细胞和鸡胚上的安全浓度。而后比较不同给药方式(先给药再加入病毒,先加入病毒再给药以及药物和病毒混合孵育后再攻毒)对NDV的作用。此外将NDV稀释液加入到DF-1细胞中通过在不同时间段提取细胞和病毒的总RNA,采用RT-PCR法定量分析NDV在不同时间段内的mRNA表达量,以此解释NDV侵染DF-1细胞的吸附、增殖和释放特性;同时采用扫描电镜观察添加病毒后细胞表面的变化,以及采用间接免疫荧光实验研究NDV在细胞内的增殖情况。最后将不同浓度(20、10、5μg/mL)的GBEP添加到细胞感染病毒的不同时间,采用RT-PCR法定量分析药物作用后NDV的表达量,以及免疫荧光法探究药物对NDV在DF-1细胞中复制特性的影响。结果:GBEP的糖含量为51.9%且不含淀粉;其红外光谱图呈典型的多糖图谱,在1250.6cm-1有较强吸收。GBEP在不高于50 μg/mL时对DF-1细胞生长无显著影响,不高于4 mg/枚鸡胚时不影响鸡胚的正常发育。抗NDV方面,在DF-1细胞上先给药后加病毒组,1.25μg/mLGBEP组的OD值即显著大于攻毒对照(P0.01),与同剂量的利巴韦林组相比无显著差异(P0.05);先加病毒后给药组,1.25μg/mLGBEP组的OD值亦显著大于攻毒对照组(P0.05),但不及同剂量的利巴韦林,但随着剂量的增加其作用加强;混合作用组GBEP的各浓度组的OD值均显著大于攻毒对照组(P0.01)与同剂量的利巴韦林组相比无显著差异(P0.05)。在鸡胚中试验中,0.8 mg GBEP/枚组的胚体发育、HA血凝价均与利巴韦林组相近,而攻毒对照组鸡胚在48 h时全部死亡。先攻毒再给GBEP组的鸡胚在48 h时出现5枚死亡,60 h时全部死亡;先给药再攻毒组中的鸡胚在同时期出现1枚死亡,而GBEP与病毒混合孵育后再攻毒组未出现死亡,且72h的胚体长度明显长于攻毒对照组(P0.05)。NDV在DF-1细胞上复制周期的检测结果表明,NDV稀释液加入到DF-1细胞后,约11Omin对细胞的吸附量达到饱和,同时在细胞表面发现有病毒粒子存在;病毒稀释液添加到细胞约13h后其在细胞内的增殖量达到最大,并呈现出明显的时间效应;病毒加入到细胞6h时,细胞上清液中即可检测到NDV,42h时NDV含量达到最大,说明病毒感染6h后即开始释放。不同浓度的GBEP和NDV同时加入到细胞后,NDV对DF-1细胞的吸附量极显著低于攻毒对照组(P0.01);在病毒进入细胞后再加入不同浓度的GBEP也可极显著降低NDV在细胞内的增殖量(P0.01);此外药物和病毒共同孵育后再加入细胞,NDV对细胞的吸附量也极显著低于攻毒对照组(P0.01):RT-PCR结果显示,各加药组的NDV-F基因的表达量都低于攻毒对照组;免疫荧光试验结果表明,各药物组的荧光强度都低于攻毒对照组。结论:以上结果表明GBEP是含有硫酸基团的酸性多糖,其在DF-1细胞和鸡胚上均具有抑制和灭活NDV作用,在DF-1细胞上的作用要好于鸡胚;此外,GBEP能够显著降低NDV对DF-1细胞的吸附和细胞内增殖。
【图文】：

２．１ＧＢＥＰ的糖含量测定逡逑根据标准曲线Ｙ＝0．１１３Ｘ＋０．４２７７，邋Ｒ２＝０．９８，将ＧＢＥＰ样品的吸光值带入算得ＧＢ的糖含量为５１．９％。逡逑２．２ＧＢＥＰ的淀粉含量测定逡逑其中１号试管为阴性蒸馏水试验结果，２号试管为阳逡逑性淀粉试管实验结果，３号试宵为ＧＢＥＰ样品试验结逡逑１逦３逦p}。从图中T以Ｈ？出阳性组（淀粉tb液）样品４碘碘逡逑化钾反应后呈蓝黑色，１号管和３号管呈无色变化，逡逑这表明ＧＢＥＰ是不含淀粉的多糖。逡逑图２为ＧＢＥＰ的碘碘化钾实验结果。逡逑Ｆｉｇ邋２邋Ｉｏｄｉｎｅ邋ｐｏｔａｓｓｉｕｍ邋ｉｏｄｉｄｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｍｅａｓｕｒｅ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋ｓｔａｒｃｈ邋ｉｎ邋ＧＢＥＰ逡逑２．３ＧＢＥＰ的红外光谱测定结果：逡逑

释液作阳性对照（取稀释液之前摇晃ＥＰ管数次，稀释液？，而后向２号试管中滴加碘－碘化钾试剂，停止滴加，而后分别向１号和３号试管滴加同１．２．２．３红外光谱扫描法对ＧＢＥＰ的结构将冻干好的ＧＢＥＰ置于红外灯下，取样品约中，用玛瑙研磨棒研细，而后加入到压片槽中做全波段（４０００－４００邋ｃｍ，，扫描。逡逑２．结果逡逑２．１ＧＢＥＰ的糖含量测定逡逑根据标准曲线Ｙ＝0．１１３Ｘ＋０．４２７７，邋Ｒ２＝０．９８，的糖含量为５１．９％。逡逑２．２ＧＢＥＰ的淀粉含量测定逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65

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本文编号：2574045