杆状病毒DNA聚合酶入核机理的初步研究

发布时间：2020-03-19 02:18

【摘要】：杆状病毒(Baculovirus)是一类特异感染节肢动物的病原微生物,它的基因组是双链超螺旋环形结构,全长约80至180 kb,通常编码89到183个基因。DNA复制是病毒增殖周期中最重要的事件。病毒一旦感染昆虫细胞,病毒粒子便释放DNA进入细胞核,病毒DNA在细胞核的病毒发生基质内开始复制。杆状病毒的DNA聚合酶(DNA polymerase,DNApol)作为病毒复制的关键酶,在细胞核内参与了病毒的复制,但是DNApol在细胞质翻译后是怎样被转运到细胞核这一过程仍不清楚。本研究通过分析β杆状病毒属菜粉蝶颗粒体病毒(Pieris rapae granulovirus,PiraGV)DNApol的核定位信号(Nuclear localization signal,NLS),以及DNApol与宿主蛋白的相互作用,深入揭示杆状病毒蛋白入核的分子机理。本论文研究结果如下所示:生物信息学分析显示PiraGV N末端有一个潜在的NLS(4LFKRKLDEPPTPTHHTLVKAIKLS 25),其既不匹配于经典单分型NLS,也没有与二分型NLS一致性的保守序列。将PiraGV的NLS与绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)融合后能够定位到细胞核,证实这段序列具有NLS的功能。多点突变分析证实NLS基序中的碱性氨基酸序列6KRK8以及20KAIK23对蛋白的入核是必不可少的。为了鉴定PiraGV DNApol的NLS能否替代α杆状病毒属斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltNPV)DNApol的NLS功能,将SpltNPV DNApol中的NLS替换为PiraGV DNApol NLS,构建了质粒pBlue-HA:Slpol~(Δnls:Prnls),将质粒pBlue-HA:Slpol~(Δnls:Prnls)转染到Sf9细胞,24h后免疫荧光分析发现NLS替代的SpltNPV DNApol不能够定位到细胞核,而是定位在细胞质。将PiraGV DNApol NLS替代的SpltNPV dnapol转座进没有dnapol的AcMNPV Bacmid中,构建了重组病毒Bac-AcΔpol:Slpol~(Δnls:Prnls)。蛋白定位分析显示NLS替代的SpltNPV DNApol也分布在细胞质中。病毒增长曲线显示在重组病毒Bac-AcΔpol:Slpol~(Δnls:Prnls)转染Sf9细胞120h后病毒滴度和野生型SpltNPV DNApol重组病毒Bac-AcΔpol:Slpol相比减少了2600倍;实时定量PCR分析显示在转染24h后重组病毒Bac-AcΔpol:Slpol~(Δnls:Prnls)基因组的拷贝数相比Bac-AcΔpol:Slpol减少19倍;在Bac-AcΔpol:Slpol~(Δnls:Prnls)转染的细胞中没有产生多角体,而Bac-AcΔpol:Slpol转染的细胞产生的多角体占转染细胞总数的3.1%。这些结果证实在SpltNPV DNApol中NLS的替换导致了感染性子代病毒的减少、病毒DNA复制产量降低以及病毒多角体的减少。为了深入地揭示杆状病毒DNApol入核的分子机制,将不同时间点野生型AcMNPV感染Sf9细胞进行转录组学分析,在注释的序列中鉴定了四个核输入蛋白α(Importinα)的同源蛋白,结果显示SfIMA1/2,SfIMA4和SfIMA7与人类Importinα1,Importinα4和Importinα7分别有46%/26%、69%和64%的氨基酸序列同源性,其中SfIMA1,SfIMA4和SfIMA7显示了典型的Importinα家族蛋白的特征,包括在N端存在一个保守的IBB结构域(Importin beta binding domain,IBB)、8个ARM(Armadillo domain,ARM结构域)重复序列以及C末端的Arm重复序列。亚细胞定位分析表明SfIMA1,SfIMA4和SfIMA7均能定位到Sf9细胞的核膜。酵母双杂交实验证实SfIMA1,SfIMA4以及SfIMA7能与带有核定位信号的AcMNPV DNApol C末端相互作用。双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,BIFC)实验进一步证实SfIMA1或SfIMA4或SfIMA7在Sf9细胞中与AcMNPV DNApol C末端共表达都有荧光互补现象。这些结果表明SfIMA1,SfIMA4和SfIMA7这三个核输入蛋白参与了AcMNPV DNApol核输入过程。
【图文】：

核型多角体病毒,单粒,电镜观察,包埋

图 1.1 单粒和多粒包埋核型多角体病毒的电镜观察[11]。ectronic microscopic analysis of morpholory of single and multiple capnucleopolyhedrovirus[11].毒的复制

杆状病毒,生命周期

状病毒的生命周期。(A) 由昆虫中肠的包涵体释放的 ODV 感染的中肠在基底方向出芽并引起全身感染。(C)感染早期产生大量 BV，将感染传播形成并嵌入 OB 中，当细胞破裂时，，OB 释放。VS：产生病毒的基质[25]he life cycle of baculoviruses.(A) OBs are diddolved in the midgut lumen ich infect the midgut cells. (B) BVs bud towards substrate and cause systeme number of BVs are produced and transmit the infection to all the tissueand embedded into OB, releasing when the cells are broken.VS: virogenic s已鉴定出 10 个病毒基因直接参与杆状病毒核衣壳组装，vp39并且其余大部分基因编码小衣壳蛋白，具有各种功能和活动处理 (p6.9、vlf-1 和 vp1054) 磷酸化调节(pk1 和 38k)，V-C42 和 vp1054)和细胞周期调控 (ODV-EC27)。这些基因的缺的表型。病毒 DNA 复制并没有受到影响。未观察到组装核衣周或 VS 的星形形状的内部空间内积累由主要衣壳蛋白的 VP结构(VP39 缺失突变体除外)。这些空的原噬菌体表明病毒基因
【学位授予单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

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