弓形虫肝素结合蛋白质ROP9、MIC3和SAG2的功能研究及其重组腺病毒的免疫原性分析

发布时间：2020-03-25 00:30

【摘要】：弓形虫病(Toxoplasmsis)是由弓形虫(Toxoplasma gondii,T.gondii)引起的食源性人兽共患寄生虫病。弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫,其宿主广泛且生活史较复杂。作为机会性致病寄生虫,弓形虫能够使免疫缺陷患者表现出弓形虫病症状,甚至死亡。全球约1/3的人口受弓形虫威胁;弓形虫也能够引起动物爆发弓形虫病,猪急性感染弓形虫死亡率可达60%。总之,弓形虫病严重威胁着人和动物的健康,并给畜牧业带来极大的经济损失。弓形虫入侵相关蛋白质在弓形虫入侵过程中发挥着关键作用,主要参与黏附宿主细胞、形成移动连接、形成和修饰纳虫空泡及调节宿主转录等过程。黏附是弓形虫入侵的第一步,弓形虫表面抗原和分泌蛋白质与宿主细胞表面受体互作,促进虫体入侵宿主细胞。硫化肝素(Heparan sulfate,HS)为广泛分布于脊椎动物细胞表面的无支链多糖,弓形虫入侵相关蛋白质与肝素/HS结合的研究相对较少。弓形虫入侵宿主细胞的分子机制尚不清晰,且弓形虫入侵相关的肝素结合蛋白质在入侵过程中行使的功能也尚未有全面报道。因此,研究弓形虫入侵相关的肝素结合蛋白质的功能,将为进一步阐明弓形虫入侵宿主细胞的分子机制奠定基础。本课题对与肝素结合的弓形虫入侵相关的棒状体蛋白质9(ROP9)、微线体蛋白质3(MIC3)和表面抗原2(SAG2)进行功能研究,不仅为揭示肝素在弓形虫入侵过程中的作用机制奠定基础,同时也为研制弓形虫新型疫苗和药物靶标提供理论依据。本研究通过对编码ROP9、MIC3和SAG2的氨基酸进行生物信息学分析,发现此三种蛋白质在弓形虫种内均具有较高的保守性,且均具有良好的B细胞表位,表明其可能是弓形虫的较重要蛋白质且具有弓形虫疫苗和诊断候选抗原的潜力。为了对弓形虫入侵相关蛋白质进行功能分析,本研究利用原核表达载体分别表达和纯化了His标签和GST标签重组蛋白质,并成功制备了特异性多克隆抗体。利用实时荧光定量PCR(Quantitive real-time PCR,RT-PCR)和Western blot对目的基因的转录水平和表达水平分析,结果发现,在弓形虫RH株中,ROP9、MIC3和SAG2的转录和表达水平在体外均高于体内。通过间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)对蛋白质在弓形虫入侵宿主细胞过程中的表达量进行分析,发现ROP9、MIC3和SAG2蛋白质在入侵的过程中的表达量明显高于游离虫体的表达量。通过肝素结合、竞争抑制及细胞黏附实验,证明了ROP9、MIC3和SAG2蛋白质能够与肝素特异性结合并黏附于宿主细胞表面。为了进一步研究封闭弓形虫或宿主细胞表面的入侵位点对虫体入侵力的影响,进行了外源肝素、蛋白质和抗体抑制虫体入侵分析,结果表明,外源肝素可以阻断弓形虫的入侵,且蛋白质MIC3、SAG2和ROP9与其高浓度的特异性多克隆抗体均可抑制T.gondii RH株虫体入侵宿主细胞。通过感染弓形虫的人血清识别蛋白质实验和蛋白质的免疫保护实验验证MIC3、SAG2和ROP9免疫识别的特性,结果提示蛋白质ROP9、MIC3和SAG2均能被免疫识别,且对BALB/c小鼠有部分的免疫保护效果。为进一步探索ROP9蛋白质对弓形虫的入侵力和毒力相关性的影响,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了弓形虫ROP9基因敲除株(RH△ROP9)和补回株(RH-Re ROP9),并通过入侵率、增殖率、胞出时间和对小鼠的致病性分析,结果发现,弓形虫ROP9基因敲除株入侵宿主细胞的速率明显下降,且对小鼠的致病性减弱。目前尚未有能完全预防和控制弓形虫病的疫苗和药物,因此,急需研发安全且有效的新型弓形虫疫苗。本研究利用已筛选出的编码弓形虫入侵相关的肝素结合蛋白质的基因进行构建重组腺病毒,并对其进行免疫原性分析。分别将弓形虫ROP9、MIC3和SAG2基因克隆至腺病毒穿梭载体,并将其与腺病骨架载体进行共转染HEK293A细胞,通过荧光显微镜观察和Western blot检测发现,成功包装出了表达目的蛋白质的重组腺病毒。将包装出的重组腺病毒分别免疫BALB/c小鼠并进行免疫原性分析,结果显示,免疫小鼠获得较高的特异性的抗弓形虫Ig G;重组腺病毒组小鼠血清中的IFN-γ、TNF-α及IL-6等Th1型细胞因子显著或极显著高于对照组(P0.05、P0.01或P0.001);二价或三价重组腺病毒组小鼠脾脏中活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞显著或极显著高于对照组(P0.05、P0.01或P0.001);且免疫小鼠的存活率及存活时间极显著增加(P0.01或P0.001)。综上所述,本研究发现弓形虫入侵相关蛋白质ROP9、MIC3和SAG2能够与肝素特异性结合,并与宿主细胞发生黏附;弓形虫ROP9蛋白质参与弓形虫的入侵,且是弓形虫的一个毒力因子;重组腺病毒免疫小鼠,能够激起小鼠的体液免疫和细胞免疫,且对小鼠有部分的免疫保护作用。该研究结果不仅为阐明弓形虫入侵宿主细胞的分子机制奠定基础,也为研发新型弓形虫疫苗提供新思路。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.7

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本文编号：2599107