基于转录组测序挖掘产蛋后期蛋鸡胫骨强度相关基因

发布时间：2020-03-27 14:11

【摘要】：禽类骨骼不仅是生命活动的基础,而且还与其生产性能密切相关。产蛋期间蛋鸡髓质骨充当机体钙源,为蛋壳形成提供钙,但随产蛋周龄增加,髓质骨钙沉积不足,皮质骨充当机体钙源,造成骨强度下降,骨脆性增加,蛋鸡生产性能下降。本研究旨在筛选与产蛋后期蛋鸡胫骨强度相关基因及遗传标记,为蛋鸡骨代谢、骨质量调控及选育相关研究提供理论基础。选择20只79周龄海兰灰蛋鸡,采集胫骨组织,左侧胫骨用于测定断裂强度,右侧胫骨液氮速冻后用于高通量测序。利用质构仪测定断裂强度,根据测量结果分为高骨断裂强度组(HBS,High bone breaking strength)和低骨断裂强度组(LBS,Low bone breaking strength),选取体重相近且胫骨强度存在差异的6个个体,定义为H组(H1/H2/H3,3只)和L组(L1/L2/L3,3只),提取RNA后构建cDNA文库和转录组测序,测序数据进行生物信息学分析。H组和L组得到的总reads数分别为50,955,168和50,772,867,分别有84.58%和85.59%序列有效地比对到鸡参考基因组。在两组间筛选出9个差异表达基因(FDR0.01),其中5个基因表达上调(OSCAR,PAX5B,和3个LincRNA)和4个基因表达下调(TIMP4,KLHL14,MPP7和1个未知基因)。GO富集分析结果表明差异表达基因富集在生物学过程(金属酶活性的负调节、Notch信号通路和蛋白质泛素化等)、细胞组成(蛋白质性细胞外基质、细胞外间隙和细胞核等)和分子功能(金属内肽酶抑制剂活性、蛋白酶结合和泛素-蛋白质连接酶活性等)。ASprofile预测得到64,941个可变剪接事件。GATK软件识别得到1,093,870个SNPs。采集20只太行鸡(40和57周龄)和18只海兰灰蛋鸡(79周龄)胫骨,提取RNA和cDNA反转录,选取7个内参基因(B_2M、LBR、HPRT1、HMBS、RPL32、18S、RPL5)进行RT-qPCR引物筛选,扩增效率均在95%以上;利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种不同算法进行稳定性筛选,综合分析结果表明B_2M和LBR为推荐稳定内参基因。采集18只海兰灰蛋鸡(79周龄)胫骨,提取RNA和cDNA反转录,利用RT-qPCR技术检测KLHL14、TIMP4、OPN和ON基因mRNA表达,结果显示,KLHL14和TIMP4基因表达水平在H组高于L组(P0.05),OPN基因表达水平在HBS组低于LBS组(P0.05),ON基因表达水平两组间无显著差异(P0.05)。利用ELISA检测血清中TIMP4和KLHL14蛋白水平,分析结果发现这两个蛋白水平与骨断裂强度无显著相关(P0.05)。对PCR产物进行直接测序,与Ensembl数据库比对分析发现,在ON基因发现6个SNPs位点,分别为13632066GA,13631903AT,13631874CT,13631916AG,13631974AC,13631916AG,13631974AC,13632074AG,但均与骨强度无显著相关(P0.05)。综上所述,高通量测序结果发现9个与产蛋后期胫骨断裂强度相关的差异表达基因,其中TIMP4和KLHL14 mRNA表达水平在产蛋后期蛋鸡不同断裂强度的胫骨中存在显著差异。蛋鸡胫骨中稳定表达的内参基因为B_2M和LBR。OPN基因mRNA表达水平在产蛋后期蛋鸡HBS组表达低于LBS组。
【图文】：

1 引言以其营养丰富、美味可口等优点成为我国城乡居民膳食的重要组成部以鸡蛋为主）生产自 1985 年来稳居全球首位，占世界鸡蛋总产量的 4骨质量问题在规模化、集约化的养殖方式下变得日益突出，其中，骨骨质量代表性问题[2]（图 1-1）。 1955 年，报告了一种“笼养蛋鸡疲劳症”的现象，其中高达 90 %的产骨折[3]。骨质疏松症是蛋鸡营养代谢性骨骼疾病的代表[4]，以骨折和[5]，表现为蛋鸡骨骼脆性增加，骨折发生率显著上升[6]，，最终形成一病[7]，制约着蛋鸡经济效益的提高[8]。骨折具有可遗传性[9]。环境和解蛋鸡骨折发生[10]，而遗传因素可以从根本上解决这一问题[11]。

增殖无明显变化，但成骨细胞特异性基因如调[60]。通过研究绝经后妇女骨质疏松症指出 OPN 有望作为的指标[61]。Wan 等指出在失重环境中，OPN 表达显，碱性磷酸酶活性下降，骨量丢失增加，认为 OPN和运动量少的人更易患骨质疏松症[62]。Huang 等研、分化及骨组织内矿物质沉积[63]。而 Philipp J 等人性显著降低[64]，说明骨桥蛋白对骨折韧性维持具有重化强度有关分子机制时发现 OPN 差异表达[65]。目前定论，说明 OPN 对成骨细胞的调节可能存在复杂的的影响M-40（Busement menbrane protein）或 SPARC（Scret），是一种富含半胱氨酸的分泌性酸性钙结合糖蛋白 285 ~ 287 个氨基酸残基组成[67]，在全身多组织多细强亲和力，且能够结合骨桥蛋白[68]。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S831.2

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5 熊q试

本文编号：2603073