DHM对雏鸡生长和免疫功能影响及其缓解LPS致肝脾损伤作用

发布时间：2020-04-03 19:21

【摘要】：脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分之一,肠道内的阴性菌溶解后可释放大量的LPS进入血液或由门静脉进入肝脏,对雏鸡的肝脏和脾脏等组织造成损伤,破坏雏鸡的免疫系统,影响雏鸡的生长性能和免疫功能,甚至导致雏鸡死亡,给家禽养殖业造成严重的经济损失。二氢杨梅素(DHM)是一种类黄酮化合物,其结构明确,存在于多种植物中,具有清除氧自由基、抗氧化和抗炎等多种生理活性,在畜牧业发展中拥有广阔的应用前景。本实验以海兰白雏鸡为研究对象,在雏鸡饲料中添加不同剂量的DHM,研究其对雏鸡生长性能和免疫功能的影响及对LPS诱导雏鸡肝脾损伤的保护作用,为DHM在兽医临床上的广泛应用提供理论基础和科学依据。试验内容如下:(1)研究DHM对雏鸡生长性能和免疫功能的影响:1日龄雏鸡适应性饲喂7 d,于雏鸡7日龄时进行新城疫疫苗免疫,然后将雏鸡分为五组,在饲料中添加不同剂量(0.025%、0.05%、0.1%、0.2%)的DHM,连续饲喂35 d。每周称量雏鸡空腹体重,计算平均日增重(ADG)和平均料重比(F/G);称量体重后心脏采血分离血清,剖取心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺和法氏囊进行称重,计算脏器指数。采用生化自动分析仪检测血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、直接胆红素(DBIL)、钙(Ca)和磷(P)的含量和谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性;ELISA法检测血清中IgG、IL-2、IFN-γ含量;血凝抑制法检测血清中新城疫抗体效价;将肝脏的部分组织进行匀浆,采用试剂盒检测肝脏匀浆中总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、总抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)含量。(2)研究DHM对雏鸡肝脏和脾脏中TLR2、TLR4及炎性因子mRNA表达的影响:将7日龄雏鸡分为五组,在饲料中添加不同剂量(0.025%、0.05%、0.1%、0.2%)的DHM,连续饲喂35 d。于雏鸡43日龄时,颈动脉放血处死雏鸡,分离肝脏和脾脏组织,用于提取总RNA,RT-PCR法检测雏鸡肝脏和脾脏中TLR2、TLR4及炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α)mRNA的表达。(3)研究DHM对LPS诱导雏鸡肝脾损伤的保护作用:将7日龄雏鸡分为五组,在饲料中添加不同剂量(0.025%、0.05%、0.1%、0.2%)的DHM,连续饲喂14 d。于雏鸡22日龄时,模型组和DHM添加组腹腔注射LPS(60 mg/kg),对照组腹腔注射等量的生理盐水,注射12 h后收集血液和肝脾组织,检测血清中ALT、AST和LDH活性及DBIL、TC和TG的含量;肝脏和脾脏的部分组织用于提取总RNA和蛋白,RT-PCR法检测雏鸡肝脏和脾脏中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB p65及炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α)mRNA的表达,western blot法检测肝脾组织中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平;肝脏和脾脏的部分组织用于制作石蜡切片和透射电镜切片,观察肝脾组织形态和超微形态。试验结果如下:(1)DHM对雏鸡生长性能影响结果:与对照组相比,0.05%DHM显著增加28日龄、35日龄和42日龄的雏鸡体重(p0.05或p0.01),增加7-21日龄雏鸡的ADG并降低22-42日龄雏鸡的F/G;在0.05%DHM添加组中,35日龄雏鸡血清中TC和TG含量显著高于对照组(p0.05),不同日龄雏鸡血清中GLU含量显著高于对照组(p0.05或p0.01),14日龄、21日龄和28日龄雏鸡血清中LDH活性和14日龄雏鸡血清中DBIL含量显著低于对照组(p0.05或p0.01)。(2)DHM对雏鸡免疫功能影响结果:在0.05%DHM添加组中,14日龄雏鸡的脾脏指数、胸腺指数和法氏囊指数及42日龄雏鸡的脾脏指数显著高于对照组(p0.05或p0.01);与对照组相比,0.025%、0.05%和0.1%DHM分别明显提高了21日龄雏鸡的脾脏指数、胸腺指数和法氏囊指数(p0.05或p0.01);在0.025%、0.05%和0.1%DHM添加组中,14日龄雏鸡血清中IL-2、IFN-γ和IgG含量极显著高于对照组(p0.01),0.05%DHM添加组中,21日龄雏鸡血清中IL-2、IFN-γ和IgG含量极显著高于对照组(p0.01);0.05%、0.1%和0.2%DHM添加组中,14日龄、28日龄和42日龄雏鸡血清中的新城疫抗体效价均明显高于对照组(p0.05或p0.01);在0.025%和0.05%DHM添加组中,21日龄和42日龄雏鸡肝脏内的GSH-Px和A-TOC活性显著高于对照组(p0.05或p0.01),0.05%DHM提高21和42日龄雏鸡肝脏内SOD活性,与对照组相比差异显著(p0.05)。(3)RT-PCR结果显示:与对照组相比,0.05%和0.1%DHM可明显促进肝脏中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10的mRNA表达,明显抑制肝脏中TLR2和TNF-α的mRNA表达(p0.05或p0.01);与对照组相比,0.05%和0.1%DHM可显著促进脾脏中TLR2、TLR4和TNF-α的mRNA表达,显著抑制脾脏中IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10的mRNA表达(p0.05或p0.01)。(4)腹腔注射LPS后,雏鸡血清中AST、ALT和LDH活性及DBIL、TG含量显著高于对照组(p0.05或p0.01),0.05%DHM可极显著降低雏鸡血清中AST和ALT及LDH活性及DBIL和TG含量(p0.01)。(5)腹腔注射LPS后,与对照组相比,TLR2的mRNA表达在肝脏和脾脏中均显著升高(p0.05或p0.01),TLR4的mRNA表达在脾脏中极显著降低(p0.01),MyD88和NF-κB p65的mRNA表达在肝脏中极显著降低而在脾脏中极显著升高(p0.01),其中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平在肝脏中无显著变化,而在脾脏中极显著降低(p0.01);IL-1β和IL-8的mRNA的表达在肝脏和脾脏中升高显著(p0.05或p0.01),IL-6的mRNA表达在肝脏中极显著降低(p0.01),IL-10的mRNA表达在肝脏和脾脏中均极显著降低(p0.01),TNF-α的mRNA表达在肝脏中升高极显著(p0.01)。与模型组相比,0.05%或0.1%DHM可极显著降低肝脏中TLR2、IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA表达(p0.01),显著升高肝脏中TLR4、MyD88、IL-6和IL-10的mRNA表达(p0.05或p0.01),DHM的添加对肝脏中NF-κB p65的mRNA表达及其磷酸化水平无显著影响;0.025%DHM可显著降低脾脏中TLR2的mRNA表达(p0.05),极显著升高脾脏中IL-10的mRNA表达(p0.01),0.05%DHM可显著升高脾脏中TLR4、IL-6和IL-10的mRNA表达(p0.01),0.05%和0.1%DHM可明显降低脾脏中MyD88、IL-1β和IL-8的mRNA表达(p0.05或p0.01);在DHM(0.05%和0.1%)添加组中,脾脏中NF-κB p65的mRNA显著降低(p0.01),而NF-κB p65蛋白的磷酸化水平极显著升高(p0.01)。(6)形态学检查结果显示,雏鸡腹腔注射LPS后,肝脏组织中细胞肿胀,肝索结构紊乱且有炎性细胞浸润,脾脏组织中白髓和红髓界限模糊;超微形态学结果显示,肝细胞的内质网中有大量空泡形成,而脾脏细胞中的内质网中有少量空泡形成。在雏鸡饲料中添加0.05%和0.1%DHM可减轻肝脏和脾脏的损伤情况,缓解LPS对雏鸡肝脏和脾脏组织造成的损伤。实验结果表明,在海兰白雏鸡饲料中添加DHM,可促进雏鸡体重的增加,改善雏鸡的生化指标,增加血清中抗体和细胞因子含量,调节雏鸡肝脏和脾脏中TLR2、TLR4和炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α)mRNA的表达;DHM可通过调节炎症反应中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB p65和炎性因子mRNA在雏鸡肝脏和脾脏中的表达,以及肝脾组织中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平,改善雏鸡肝脾组织的损伤程度。综上可知,0.05%DHM可提高雏鸡的生长性能和免疫功能,缓解LPS对雏鸡造成的肝脾损伤。
【图文】：

二氢杨梅素,结构式

二氢杨梅素结构式Fig.1-1Thestructuralformulaofdihydromyricetin

雏鸡,料重比,平均日增重,血清生化指标

图 3-1 DHM 对雏鸡平均日增重和料重比的影响（n=10）Fig. 3-1 Effect of DHM on average daily gain and feed to gain ratio of chicks（n=10）3.1.3 DHM 对雏鸡血清生化指标的影响3.1.3.1 雏鸡血清中总蛋白和白蛋白的含量变化
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S831.5

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