BVDV、BPV、BPIV探针qRT-PCR检测方法的建立及初步应用

发布时间：2020-04-16 20:56

【摘要】：随着生产力水平的提升,国家大力发展畜牧业,奶牛、肉牛养殖逐渐呈现规模化、机械化、产业化,许多从前散发性流行的疫病,现都呈现群发的趋势,从而也对病原监测提出了更高的要求。相比以前农户散养方式不同,许多病原由于地方局限性,多呈地方性流行,如今进出口、进出境贸易的频繁加速了这些疫病的传播,加之某些疫病呈隐性感染,成为畜牧业的最大隐患。因此,有效的诊疗手段是当今畜牧贸易检疫重要的一环。本研究应用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技术,建立针对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛细小病毒(Bovine parvovirus,BPV)、牛副流感病毒(Bovine parainfluenza virus,BPIV)等常见病原的快速检测方法。经过比对GenBank中多条BVDV 1型5’-UTR基因、BPV的主要结构蛋白VP2基因以及BPIV的核蛋白N基因的序列,各自设计了一对特异性引物和带有不同荧光基团的探针,并建立了BVDV、BPV和BPIV 3种探针qRT-PCR,同时还建立了BPV和BPIV双重TaqMan qRT-PCR检测方法。分别通过对退火温度、引物浓度、探针浓度等条件的双重优化,结果显示,建立的三种探针qRT-PCR和双重TaqMan qRT-PCR均具有良好的重复性和敏感性。建立的BVDV探针qRT-PCR方法,在检测BVDV特异性时,只能特异性地检测出BVDV,而对同科同属病毒CSFV和同科不同属的JEV、RABV均无法扩增,表明该法能鉴别出同科同属的病毒,特异性强;线性关系好,以标准质粒pMD18-T-BVDV 5’-UTR建立的标准曲线,相关系数达0.999%以上;敏感性高,最低能检测到1.55个拷贝数(copies)/μL的BVDV标准质粒,比普通PCR高100000倍;重复性好,组内和组间变异系数都小于1.7%。建立的BPV和BPIV探针qRT-PCR检测方法,一样具有强特异性、高敏感性和好的重复性。它们在检测其他病原时,探针均未与非特异性模板发生结合;BPV和BPIV法检测限度比普通PCR分别提高了10000倍和100倍;其组内和组间重复性均小于1.65%。用建立的BPV TaqMan荧光定量检测43份腹泻犊牛粪便样品时,结果BPV阳性有4份,阳性率为9.30%。在建立特异性、敏感性和重复性好的基础上,建立多重荧光定量PCR,可以减少试剂、样品的浪费,节约时间成本,提高工作效率。利用本法建立的BPV和BPIV双重荧光定量PCR检测牛常见病原时,仅能特异性检出BPV和BPIV的cDNA,说明该法具有很强的特异性且探针之间互不干扰。该法最低能够检出2.0×10~1 copies/μL pMD18-T-BPV和2.0×10~2 copies/μL pMD18-T-BPIV,组内和组间的重复性试验显示其变异系数均小于1.2%。总之,本研究成功建立了3种探针qRT-PCR检测方法和1个双重荧光定量PCR检测方法,给牛BVDV、BPV、BPIV检测提供技术手段。
【图文】：

模式图,基因组结构,模式图,蛋白

北民族大学生命科学与工程学院 2019 届硕士研究生学和一个含有抗原决定位点的羧基端，，在他们的结必须与 N 蛋白和 RNA 结合（氨基端）才能为 PP 蛋白和 L 蛋白依赖的 RNA 聚合酶两个亚基能调节病毒 RNA 的合成[96]。非糖基化的 M 蛋白毒组装的核心过程[97]，是病毒复制增殖过程必

基因,PCR扩增,反应体系,试剂用量

图 2 BVDV 5’UTR 基因 PCR 扩增. 2. The PCR amplification of BVDV 5’UTR 100bp DNA Marker; 1: BVDV 5’UTR PCRA Marker; 1, PCR amplification product of时荧光定量 PCR 反应体系及条件优的优化，最终获得了 BVDV TaqMan 9。VDV TaqMan 实时荧光定量 PCR 反应体系VDV TaqMan qRT-PCR reaction system and试剂用量VolumeProbe qPCR）（2×） 10μL .5μmol/L） 0.4μL
【学位授予单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23

【参考文献】