鹅细小病毒结构蛋白真核表达质粒的构建及免疫原性初探

发布时间：2017-03-23 06:12

  本文关键词：鹅细小病毒结构蛋白真核表达质粒的构建及免疫原性初探，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：小鹅瘟是由鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起的雏鹅急性败血性传染病。病鹅的临诊特点是精神委顿、食欲废绝、严重下痢、有时会出现神经症状。当前尚无治疗该病的特效药物,主要通过对开产前种鹅与雏鹅使用传统疫苗及高免血清进行预防。我国是全世界最大的水禽养殖国家,随着人民生活水平不断提高,对禽类肉蛋的需求不断增加,加上本病传播快、感染性强、致死率高、每年都有不同程度的流行,严重危害了养鹅业的发展,这要求我们应该深入了解该病毒的分子生物学特征及致病机制。本研究的主要内容有以下几点：1.将GPV的三个衣壳蛋白分别连接到真核表达载体上,构建出pcDNA3.1-VP1、 pcDNA3.1-VP2和pcDNA3.1-VP3重组质粒,以脂质体转染法将这三种质粒分别转染到哺乳动物细胞系和原代鹅胚成纤维细胞系(Goose embryo fibroblast, GEF),采用western blot的方法检测目的蛋白的表达情况。结果显示,重组VP1、VP2和VP3蛋白能分别与抗his标签抗体和抗GPV多抗血清在蛋白分子质量标准80 kDa、70 kDa和60 kDa附近发生特异性结合。说明这三种重组质粒能在同源及异源细胞中有效表达,为后续实验奠定了基础。2.利用GEF和鹅外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)为模型比较三种衣壳蛋白的细胞免疫原性。本研究将VPs的三种重组质粒转染GEF,60 h后收获细胞并提取总RNA,以实时荧光定量PCR (Real-time PCR,RT-PCR)的方法检测IL-6和IL-1β、FNs的转录水平。基于此,将GEF表达的VPs用于处理PBMCs,共孵育6 h,收集细胞抽提RNA检测CD4、CD8α、IL-6、IL-1β和IFNs的表达情况。还将GEF中表达的VP2经超离纯化、磷钨酸负染色后在透射电镜下观察。结果发现,VP2和VP3在GEF和PBMCs中都可显著上调IL-6和IL-1β的mRNA表达量。在PBMCs模型中,VP1诱导产生的细胞因子与实验对照相比无明显差异；而VP2还可显著上调IFNγ和IFNλ的量；VP3处理组的CD8α表达量显著高于VP1和VP2处理组。以上结果说明VP2和VP3的细胞免疫原性要优于VP1,且VP2在GEF中表达可形成病毒样颗粒。3.基于我们前期研究结果,VP2被挑选出作为DNA疫苗候选基因,再联合不同佐剂共同以肌肉途径免疫雏鹅,分别在免疫0d、7d、14d、21 d、28 d的时间点采集血液样品,采用RT-PCR和间接ELISA的方法分别检测被免疫雏鹅血液中CD4、 CD8α、IL-1β、IL-18、IFNs等细胞因子的转录水平变化,以及血清中特异性GPV IgY抗体水平,最后对几种免疫佐剂的免疫效果进行比较分析。结果显示,在免疫后的28 d内,CD4和CD8a的表达水平整体呈上升趋势；在免疫后第7d和第14 d,pcDNA3.1-VP2免疫组鹅血液中CD8a的表达水平显著上升；pcDNA3.1-VP2组也在第7d显著上调了IFNλ的表达；此外,pcDNA3.1-VP2与ODN2006佐剂联合免疫组分别在第7d和第21d显著上调了IL-1β和IL-18的表达。血清中特异性IgY抗体检测结果显示：除对照组外的三组实验组在免疫后14 d开始抗体增加,并随着时间增加而升高,至28 d时,抗体水平达到最高；pcDNA3.1-VP2、pcDNA3.1-VP2+MPLA、 pcDNA3.1-VP2+ODN2006免疫组的抗体水平均显著高于阴性对照组,但是不同佐剂组之间无差异。此外,在第21 d时pcDNA3.1-VP2免疫组的抗体水平显著高于阴性对照组。
【关键词】：鹅细小病毒 VPs 细胞因子 佐剂 体液免疫
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 缩略词表7-10
• 第一章 文献综述10-18
• 1 鹅细小病毒概述10-15
• 1.1 鹅细小病毒的发现及归类10-11
• 1.2 鹅细小病毒的特征11-12
• 1.3 鹅细小病毒基因组及其编码的蛋白12-15
• 2 禽类基因疫苗研究进展15-17
• 2.1 禽类基因疫苗15-16
• 2.2 佐剂的应用16-17
• 3 本研究的目的与意义17-18
• 第二章 鹅细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3真核表达载体的构建及表达18-40
• 1 实验材料18-20
• 1.1 实验动物18
• 1.2 毒株,菌种和质粒18
• 1.3 实验仪器18-19
• 1.4 实验试剂及相关溶液配制19-20
• 2 实验方法20-30
• 2.1 GPV VP1/VP2/VP3目的片段的扩增20-23
• 2.2 重组表达质粒的构建23-26
• 2.3 GPV的鼠多克隆抗体制备26-27
• 2.4 pcDNA3.1-VP1,pcDNA3.1-VP2和pcDNA3.1-VP3在细胞中的表达及验证27-30
• 3 实验结果30-37
• 3.1 目的基因的扩增30-32
• 3.2 重组表达质粒的构建32-34
• 3.3 重组质粒在293T细胞中的表达34-35
• 3.4 重组质粒在鹅胚成纤维细胞中的表达35-37
• 4 讨论37-39
• 4.1 重组质粒的构建策略37
• 4.2 细胞的培养37-38
• 4.3 细胞转染38-39
• 5 小结39-40
• 第三章 VPs在不同细胞模型中诱导的免疫应答比较40-50
• 1 实验材料40-41
• 1.1 实验动物40
• 1.2 实验仪器40-41
• 1.3 实验试剂41
• 2 实验方法41-45
• 2.1 pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2、pcDNA3.1-VP3和pcDNA3.1转染鹅胚成纤维细胞的免疫应答检测41-43
• 2.2 VPs处理鹅外周血单核细胞的免疫应答检测43-44
• 2.3 VP2病毒样颗粒的纯化与鉴定44-45
• 3 结果45-48
• 3.1 pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2、pcDNA3.1-VP3和pcDNA3.1转染鹅胚成纤维细胞的免疫应答检测45-46
• 3.2 VPs处理鹅外周血单核细胞的免疫应答检测46-48
• 3.3 VP2病毒样颗粒的电镜观察48
• 4 讨论48-49
• 5 小结49-50
• 第四章 MPLA和ODN2006作为VP2基因疫苗佐剂诱导的免疫应答50-59
• 1 实验材料50-51
• 1.1 实验动物50-51
• 1.2 实验仪器51
• 1.3 实验试剂51
• 2 试验方法51-54
• 2.1 基因疫苗的大量制备51
• 2.2 实验动物的分组及免疫51-52
• 2.3 血样的采集和处理52
• 2.4 鹅血液细胞因子变化量检测52-53
• 2.5 特异性GPV血清IgY抗体的间接ELISA测定53-54
• 3 结果54-57
• 3.1 鹅血液细胞因子变化量检测54-56
• 3.2 特异性GPV血清IgY抗体的变化56-57
• 4 讨论57-58
• 4.1 雏鹅免疫后血液细胞因子的转录水平变化57
• 4.2 雏鹅免疫后血清IgY抗体的变化57-58
• 5 小结58-59
• 参考文献59-64
• 致谢64-65
• 作者简介及论文发表情况65

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 田丽红,王君伟,贾永清;鹅细小病毒分子生物学研究进展[J];黑龙江畜牧兽医;2002年06期

2 孟学平;鹅细小病毒研究进展[J];内蒙古民族大学学报(自然科学版);2004年02期

3 李福伟;李惠敏;曹顶国;韩海霞;张桂红;;鹅细小病毒的分子生物学研究概况[J];水禽世界;2007年01期

4 陈晓月;赵承辉;;1株鹅细小病毒的分离鉴定[J];中国兽医杂志;2007年02期

5 黄宇翔;李洪彬;刘力威;;鹅细小病毒的分离鉴定及生物学特性研究[J];黑龙江畜牧兽医;2008年02期

6 李立莉;王峰;李洪艳;;鹅细小病毒分子生物学研究进展[J];养殖技术顾问;2008年01期

7 秦顺华;覃芳芸;颜健华;潘杰;胡丽萍;杨荣;付薇;熊毅;;鹅细小病毒广西株的分离鉴定[J];动物医学进展;2009年05期

8 姜凤华;高庆田;;丹东地区鹅细小病毒的分离与鉴定[J];中国畜禽种业;2010年05期

9 杜秋明;鲁承;高建伟;赵文婧;申峰勇;孟其麟;;鹅细小病毒单克隆抗体的制备与鉴定[J];中国畜牧兽医;2011年02期

10 马磊;董浩;蒋运博;段小波;谷松至;胡桂学;;鹅细小病毒研究进展[J];中国畜牧兽医;2011年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 吕雪峰;吉凤涛;刘云志;苏双;;鹅细小病毒研究现状[A];低碳经济与科学发展——吉林省第六届科学技术学术年会论文集[C];2010年

2 李琳;常哲;辛英;邵洪泽;毛文智;;鹅细小病毒病的研究进展[A];科技创新与节能减排——吉林省第五届科学技术学术年会论文集（下册）[C];2008年

3 万春和;朱海侠;黄瑜;彭春香;程龙飞;施少华;傅光华;陈红梅;;一株鹅细小病毒全基因特征分析[A];第四届中国水禽发展大会会刊[C];2011年

4 周春宇;程安春;汪铭书;;间接免疫荧光检测石蜡切片中鹅细小病毒方法的建立[A];第六届全国会员代表大学暨第11次学术研讨会论文集（下）[C];2005年

5 周春宇;程安春;汪铭书;;间接免疫荧光检测石蜡切片中鹅细小病毒方法的建立[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集[C];2005年

6 万春和;朱海侠;黄瑜;彭春香;程龙飞;施少华;傅光华;陈红梅;;一株鹅细小病毒全基因特征分析[A];福建省科协第十一届学术年会畜牧兽医分会论文集[C];2011年

7 朱小丽;程晓霞;陈仕龙;林锋强;王劭;陈少莺;;鹅细小病毒杂交瘤细胞株的建立与筛选[A];福建省科协第八届学术年会分会场“转变饲养方式，促进海西畜牧业和谐发展”学术年会论文集[C];2008年

8 程晓霞;陈仕龙;陈少莺;林锋强;王劭;朱小丽;;番鸭细小病毒和鹅细小病毒的抗原相关性研究[A];2013年福建省畜牧兽医学术年会论文集[C];2013年

9 刘家森;姜骞;司昌德;韩凌霞;曲连东;;番鸭细小病毒和鹅细小病毒PCR诊断方法的建立[A];中国实验动物学会第七届学术年会论文集[C];2006年

10 马君;章金刚;向华;李雪梅;史秋梅;宣华;;鹅细小病毒主要结构蛋白基因的克隆、测序及载体的构建[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 华南农业大学兽医学院 张桂红 罗开健;一例鹅细小病毒病的诊治[N];江苏农业科技报;2006年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 赵丽荣;鹅细小病毒结构蛋白基因遗传进化分析及其基因免疫研究[D];东北农业大学;2006年

2 丁轲;鹅细小病毒VP3基因与鹅白细胞介素-2基因分泌性融合表达载体的构建及在乳酸杆菌中表达的研究[D];四川农业大学;2006年

3 鲜思美;水禽重要疫病的多重PCR与基因芯片检测技术研究[D];四川农业大学;2009年

4 魏双施;重组鹅IL-17对鹅细小病毒VP3黏膜免疫增强作用的研究[D];东北农业大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 邵周伍林;鹅细小病毒传代致弱毒株的培育及胶体金免疫层析检测方法的建立[D];中国农业科学院;2015年

2 张双;鸭胚成纤维细胞翻译延伸因子对鹅细小病毒增殖的影响[D];吉林农业大学;2015年

3 涂梦雨;鹅细小病毒结构蛋白真核表达质粒的构建及免疫原性初探[D];四川农业大学;2016年

4 荆志强;鹅细小病毒抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制[D];东北农业大学;2010年

5 李琳;鹅细小病毒病油乳剂灭活疫苗的研制[D];吉林大学;2008年

6 周春宇;间接免疫组化和间接免疫荧光检测石蜡切片中鹅细小病毒方法的建立及其在雏鹅体内病毒分布规律的研究[D];四川农业大学;2005年

7 刘大鹏;鸭源抗鹅细小病毒卵黄抗体的制备[D];东北农业大学;2011年

8 徐浩;鹅细小病毒的分离鉴定及其全基因测序及结构蛋白的表达[D];吉林农业大学;2014年

9 马波;鹅细小病毒VP1基因的克隆、序列分析及表达载体的构建[D];东北农业大学;2002年

10 马磊;GPV原位PCR和免疫荧光检测方法的建立及其在雏鹅体内定植研究[D];吉林农业大学;2011年

  本文关键词：鹅细小病毒结构蛋白真核表达质粒的构建及免疫原性初探，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：263108