犬腺病毒Ⅰ型强毒株感染实验犬模型中干扰素转录水平的分析

发布时间：2020-04-20 12:46

【摘要】：犬Ⅰ型腺病毒(Canine adenovirus type 1,CAV-1)感染犬可引起犬传染性肝炎(Infectious canine hepatitis,ICH),该病具有传染性强、发病率高、致死率高的特点,对犬养殖业造成了极大的危害和经济损失。本研究旨在建立CAV-1犬感染模型,以对评价ICH疫苗以及药物的疗效提供参考。首先,本实验建立了一系列CAV-1的检测手段,包括分子生物学检测方法PCR和定量PCR以及用于血清抗体检测的血清学检测方法间接免疫荧光试验(Indirect immunoinfluscent assay,IFA)和血凝抑制(Hemagglutnation inhibition,HI)试验。其次,我们利用普通级2月龄比格犬建立感染模型。对犬进行肌肉注射接种CAV-1同剂量(10~5.7.7 TCID_(50)/2 mL)感染后,对其排毒情况、组织带毒、病毒血症进行检测。结果表明,三只攻毒犬出现不同程度的临床症状、大体病变和组织学病毒分布:1、母源抗体水平低、体重轻的犬临床症状最明显,体温升高最快并出现血便,体内病毒扩散最广,组织中病毒含量最高;2、母源抗体水平低、体重大或母源抗体水平高、体重轻的犬均未见明显的临床症状;3、病毒的组织学分布程度说明在建立犬感染CAV-1模型时应考虑单位体重的病毒接种剂量和犬的母源抗体,即在制备和评估发病模型时,必须考虑实验动物的本底质量。利用普通级2月龄比格犬建立感染模型,通过后肢肌肉注射10~(5.2)TCID_(50)/kg犬腺病毒I型CAV-1株。各项指标显示,体温于2 dpi达到最高值;临床症状显示2 dpi有便血,6 dpi有轻度腹泻;排毒情况:于10 dpi口腔开始出现排毒情况;血液中病毒检测于3 dpi病毒含量达到最高;病毒主要组织分布于胸腺,腹股沟淋巴结,颌下淋巴结,肠系膜淋巴结,肝脏;血清抗体HI效价为1:320。为了探究CAV-1感染犬体内发挥主导作用及有潜力药用价值的干扰素(Interferon,IFN)类型,我们先后对体外CAV-1感染的犬肾上皮细胞系(Madin darby canine kidney,MDCK)、体内CAV-1感染比格犬的血液及肝脏中各干扰素转录水平进行了检测。结果表明,在体外,CAV-1处理的MDCK细胞中IFN-α转录水平较高,Poly I:C处理的MDCK细胞中IFN-λ1、IFN-λ3转录水平较高,并且可能先后发挥着重要作用。对于体内,感染犬的血液中干扰素受体分子IFN-βR、IFN-λ1R和IFN-λ3R最先开始大量转录,而肝脏中IFN-λ1R转录水平较高。本研究表明在治疗犬传染性肝炎发病犬时,应更多考虑III型干扰素的作用。
【图文】：

示意图,结构组成,示意图,犬腺病毒

的疫苗或药物，感染动物模型对于疫苗及药物疗效的评价至关重要。干扰素治疗犬病（尹柏双，等，2007），但对新发现的ⅠⅠⅠ型干扰中发挥作用，而犬腺病毒会引起感染犬的呼吸症状，故猜想ⅠⅠⅠ型本研究利用标准化的比格犬进行人工感染实验建立动物感染模型，目打下基础。同时对体内各干扰素水平进行了测定，以期为干扰素防制了参考。腺病毒概述构于腺病毒科哺乳动物腺病毒属，分为犬腺病毒 1 型和犬腺病毒 2 型（2, CAV-2）。CAV-1 属于无囊膜病毒，其直径约为 80 nm 左右。其形毒相似，均呈二十面体立体对称结构，蛋白质衣壳由 252 个壳粒组成、纤突等结构(图 1.1)。其中在五邻体的纤突上有一个球状物，球状物细胞时可通过球状物结合细胞受体。

犬腺病毒Ⅰ型,基因组

图 1.2 犬腺病毒Ⅰ型基因组图Fig 1.2 Schematic diagram of genome of CAV-1CAV-1 核酸为线状双链 DNA 分子，基因组全长约为 31 kb 左右，CAV-2 基因组全长约为 32.2 kb左右，两者同源性约为 70%左右，基因水平仅约有 56.6%的相关性(Jouvenne, et al., 1987)。可将CAV-1 基因组划分为 E1-E4 和 L1-L5，其中 E1 和 E2 可分为 A 和 B 区域(Morrison, et al., 1997)，共编码 15 种多肽(图 1.2)，其中占总蛋白量 90%以上的最主要的结构性蛋白包括五邻体、六邻体、纤突、核衣壳等。五邻粒由基底和纤突组成，基底位于腺病毒二十面体的顶角，纤突与基底以非共价键相连，每个基底由 5 个多肽分子组成，纤突由 3 个多肽组成。纤突的氨基酸保守区位于底部，远端为 C 末端，中间由脯氨酸以及疏水性氨基酸残基组成，这段基因不保守，与腺病毒的抗原特异性有关(王东，2009)。六邻体上有补体结合反应抗原，五邻体为完全可溶性血凝素。各部分的抗原决定簇的结合特性有所差异，以六邻体最明显(Marusyk, et al., 1970; Marusyk, et al.,1972)。其中 E1 为必需区，E3 区为病毒复制非必需区，缺失 E3 对病毒的复制没有影响(Short, et al.,2010; Kalyuzhniy, et al., 2008)。目前很多研究可用外源片段替代 E3 区插入到基因中，，使得腺病毒成为很好的载体(Xiu-Zhen Li, et al., 2015; 李秀博, 等, 2017; 葛艳华, 2009)。该病毒序列较保守，但最近有发现(Wong M, et al., 2017)CAV-1 毒株在 pVⅢ基因序列与 CAV-2 有所变异。1.2.2 宿主范围
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.292

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