牛蒡苷元的制备及其抗PCV2和PRRSV活性研究

发布时间：2020-04-20 14:23

【摘要】：中草药在我国具有悠久的历史,尤其在病毒性疾病防治方面具有独特的优势。一些中草药及其成分不仅能直接影响病毒复制,还能调节机体免疫功能。猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是危害全球养猪业的重要病原,均可导致机体免疫抑制,引起其他病原微生物的继发或并发感染,从而造成巨大的经济损失。因此,除了依靠疫苗免疫,探讨控制PCV2和PRRSV感染的新策略十分必要。本研究从牛蒡子中提取活性成分牛蒡苷元(ACT),分析其在体内外对PCV2和PRRSV的抗病毒活性,以期为猪圆环病毒病(PCVAD)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的防控以及ACT的开发应用提供科学依据。牛蒡子粗粉经脱脂后用含5%盐酸的50%乙醇溶液回流5h,过滤后药渣用50%乙醇溶液重复提取1h,合并滤液,用5mol/L NaOH溶液调节至中性,氯仿萃取两次,减压旋转蒸干后获得ACT粗品,经两次硅胶柱层析纯化获得ACT;三批次提取的ACT平均百分含量为98.2%,平均提取率为1.62%。分析了 ACT对PCV2在PK-15细胞及小鼠体内增殖的影响。结果显示,15.6-62.5μg/mLACT能够明显抑制PCV2在PK-15细胞上的增殖(p0.01);进一步小鼠试验显示,按每公斤体重0.2mg腹腔注射ACT能够明显抑制PCV2在小鼠肺、脾及腹股沟淋巴结组织内的增殖(p0.01)。分析了 ACT对人工感染PCV2仔猪体内病毒增殖及组织病理学影响。结果显示,攻毒前按剂量20μg/kg和50μg/kg连续给药3天均能显著抑制攻毒后7、14和21d仔猪外周血病毒载量(p0.05,p0.01);攻毒后21d将全部试验仔猪剖杀,发现给药组1(20 μg/kg)能显著抑制PCV2在腹股沟淋巴结(p0.05)、肠系膜淋巴结(p0.05)组织中的增殖,给药组2(50μg/kg)还能显著抑制PCV2在扁桃体(p0.05)和肺(p0.05)组织中的增殖;病理切片和组织病理学评分结果显示,两个剂量ACT均能减轻PCV2感染造成的上述脏器组织的病理损伤。分析了 ACT对PRRSV体外增殖的影响。结果显示,12.5-100μg/mL的ACT对1OOTCID50及10TCID50PRRSV均显示出显著的直接灭活作用(p0.01);0.39-100μg/mLACT能显著抑制100TCID50及 10TCID50PRRSV 在 MARC-145 细胞的增殖(p0.01);而 0.19-100μg/mLACT 预处理细胞并不能影响PRRSV的感染和增殖。从细胞周期调控角度探讨了 ACT抑制PCV2增殖的机理。结果显示,62.5μg/mLACT能抑制PCV2感染导致的PK-15细胞S期延迟(p0.01);同时抑制CyclinE2、CDK2、p53的转录和表达。表明ACT可能通过抑制CyclinE2、CDK2、p53蛋白的表达影响细胞周期分布,从而抑制PCV2在PK-15细胞的增殖。综上,本研究建立了一种简便、稳定的ACT制备方法,并对ACT在体内外抗PCV2和PRRSV感染的作用和效果进行了研究分析。结果表明,ACT对PCV2在细胞、小鼠及仔猪的增殖均具有良好的抑制效果,在体外对PRRSV也具有一定的直接灭活和抑制作用,并发现ACT可能通过调控细胞周期抑制PCV2在PK-15细胞的增殖。研究结果为进一步挖掘ACT抗病毒机理及临床防控PCVAD和PRRS提供了试验依据。
【图文】：

学博士学位论文逦第三章牛蒡苷元对ＰＣＶ２在ＰＫ－１５细胞及小鼠体内增果逡逑Ｖ２定量ＰＣＲ检测方法的建立逡逑定纯化的ＰＣＶ２卩丨丨性克隆质粒浓度为０．２ｐｇ／ｎＬ，折算含有ｌｘＫ＾ｃｏｐｉｅｓ尔Ｌ。将化质粒进行１０倍梯度稀释，进行扩增反应，扩增曲线见图２－１。标准曲线如图２为－３．９６７８９０，相关系数为０．９９６２９１，截距为５５．９０６４１４，直线方程为逡逑９０ｘ＋５５．９０６４１４，其中ｙ为循环阈值，ｘ为质粒模板的拷贝数。逡逑［Ｊｔｌｌｉ邋Ｒｎ邋Ｃｖｃｌ？逡逑

学博士学位论文逦第三章牛蒡苷元对ＰＣＶ２在ＰＫ－１５细胞及小鼠体内增果逡逑Ｖ２定量ＰＣＲ检测方法的建立逡逑定纯化的ＰＣＶ２卩丨丨性克隆质粒浓度为０．２ｐｇ／ｎＬ，折算含有ｌｘＫ＾ｃｏｐｉｅｓ尔Ｌ。将化质粒进行１０倍梯度稀释，进行扩增反应，，扩增曲线见图２－１。标准曲线如图２为－３．９６７８９０，相关系数为０．９９６２９１，截距为５５．９０６４１４，直线方程为逡逑９０ｘ＋５５．９０６４１４，其中ｙ为循环阈值，ｘ为质粒模板的拷贝数。逡逑［Ｊｔｌｌｉ邋Ｒｎ邋Ｃｖｃｌ？逡逑
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S853.7

【参考文献】

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本文编号：2634640