肝片吸虫病诊断抗原的筛选及间接ELISA方法的建立

发布时间：2020-04-23 05:35

【摘要】：肝片吸虫病是由肝片形吸虫(Fasciola hepatica)寄生于牛、羊等反刍动物的肝脏和肝胆管内而引起的一种吸虫病。本病呈世界性流行,据统计,全球约有2.5亿-3亿牛、羊感染片形吸虫,每年因片形吸虫感染造成的经济损失超过30亿美元,特别重要的是,该虫还可感染人,是一种非常重要的人兽共患病病原。因此,肝片吸虫病不仅给畜牧业生产带来巨大经济损失,同时也给人类健康带来极大威胁。目前,我国对肝片吸虫病的诊断主要以虫卵检查法和剖检法为主,但虫卵检查只能检测肝片吸虫感染晚期的动物,而肝片吸虫对动物的危害则主要集中在感染早期的移行阶段;剖检法是对疑似感染的动物进行剖杀检查,不适用于活体诊断。近年来发展了一些免疫学诊断方法,如间接血凝、ELISA方法等,但这些方法多处在实验室研究阶段,还没有在临床中大面积应用。虽然国外已有商品化的诊断试剂盒,但其价格十分昂贵。因此,我们急需建立一种早期、敏感,特异的诊断方法,为其市场化奠定基础。利用本实验室前期研究的绵羊肝片吸虫阳性血清与肝片吸虫排泄分泌抗原免疫共沉淀产物的质谱分析结果,筛选出5种存在于肝片吸虫生长发育各个时期的蛋白,分别为组织蛋白酶L1(Cathepsin L1,CL1)、组织蛋白酶L2(Cathepsin L2,CL2)、热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)、亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase,LAP)和天冬氨酰内肽酶(Legumain,LEG),其中LEG在肝片吸虫蛋白中的研究还未见报道。通过RT-PCR获得肝片吸虫的cDNA,设计特异性引物扩增出5种蛋白的基因片段,目的片段经双酶切后,连接至表达载体pET-28a(+)中,将连接产物转化至BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE,确定蛋白正确表达后再Western blot分析蛋白是否具有反应原性。对蛋白的纯化方法及条件进行优化,收集纯化后的蛋白并进行浓度测定。蛋白纯化后,对5种蛋白进行棋盘法ELISA检测,棋盘法结果进行分析后,根据P/N值筛选出CL1为最适ELISA诊断蛋白进行后续优化实验。优化间接ELISA反应条件,包括包被液选择、包被蛋白浓度、封闭液选择及封闭时间摸索、一抗、二抗浓度、血清中非特异性因素的去除、特异性实验、敏感性实验及阴阳性临界值确定等。结果表明:最佳包被液为碳酸盐缓冲液(CBS),包被抗原最适浓度为7.5μg/mL,最佳封闭液为5%的脱脂乳,最佳封闭温度及时间为37℃2 h,最佳一抗稀释浓度为1:200,37℃孵育2 h,二抗按照1:10000倍稀释最佳;建立的间接ELISA诊断方法不与大片吸虫、日本血吸虫等阳性血清发生交叉反应。本方法重复性好,批内及批间的变异系数均低于10%,特异性为97.3%,敏感性为94.0%,最早可以检出人工感染28天的肝片吸虫绵羊血清。与国外商品化诊断试剂盒比较其符合率为99.1%。临床检测了黑龙江省及吉林省的绵羊308份血清,阳性率为3.9%。本实验成功地表达了5种蛋白,筛选出了反应原性良好,能适用于肝片吸虫病诊断的蛋白——组织蛋白酶L1,并利用该蛋白作为诊断抗原建立了检测肝片吸虫抗体的间接ELISA方法,该方法具有早期、敏感、特异、价格低廉等优点。为肝片吸虫病诊断试剂盒的研究奠定基础。
【图文】：

同时也可感染人[1-3]。本病呈世界性流行并且分布较广，主要分布于欧洲、非洲、亚洲、美洲等地（见图1.1）。如南美洲国家智利[4]1989-1995 年肝片吸虫的感染情况绵羊的感染率为 2.1%，牛的感染率为 30.1%；阿根廷[5]北部地区的 12-18 个月龄的绵羊的感染率为 4.8%，5 岁以上的绵羊的感染率则上升为 77%，，可见随着动物年龄的增高感染情况也加重；玻利维亚[6]1992-1994 年间据不完全统计全国感染肝片吸虫牛为 15.4。北美洲墨西哥北部[7]，经过粪便检查法检出的牛肝片吸虫的患病率为 11.4%，ELISA 的检出率为 14.4%，山羊的粪便检出率为 24.5%，ELISA 检出率为 43%

肝片吸虫病诊断抗原的筛选及间接 ELISA 方法的建立早期童虫在穿过肠壁进入腹腔过程中，不断破坏组织并以组织为食[30-35]。童虫在肝脏实质中移行时以肝细胞为食。此时期对肝脏的损伤较大，引起广泛的损伤性肝炎[36-39]。胆管上皮出现增生现象[40-41]。当肝片吸虫大量寄生时，可导致胆管堵塞，严重会使动物死亡[42-43]。肝片吸虫病会引起宿主广泛肝组织损伤及贫血，长期化学药物治疗不仅不会预防重复感染，还可能产生耐药性[44-47]。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S855.9

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本文编号：2637409