过去五年10株ALV-J分离株全基因序列分析及接种ALV-J污染的活疫苗对三黄鸡的致病性研究

发布时间：2020-04-24 23:41

【摘要】：为了解广西地区禽白血病(avian leukosis,AL)的流行情况和及时掌握毒株的变异趋势,本研究对2014-2018过去5年广西地区不同养殖场送检至本实验的临床发病剖检疑似有典型AL症状的鸡只进行禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)的分离与鉴定。通过将其血浆或病变组织样品的滤过液接种至DF-1进行细胞培养病毒分离,将收集的细胞培养物上清液进行ALV-p27检测,检测结果为阳性的样品进一步进行其它病原的PCR鉴定以及ALV亚群的PCR扩增,并用单克隆抗体进行IFA确定ALV的亚群,从中挑选确定为ALV-J单一感染的10株病毒分离株进行全基因序列测定与分析。结果显示,10株分离毒的基因组全长在7583～7648 bp之间,其核苷酸、氨基酸之间的相似性都较高分别为96.0%～98.8%、96.8%～98.9%,分离株与ALV-J参考株的相似性在91%以上,而与ALV-A、B、C、D、E、K亚群的相似均较低至63.1%～86.3%。遗传进化树分析的结果显示,分离株与ALV-J参考株的亲缘关系近同属于一个大分支,而与ALV-A、B、C、D、E、K亚群的参考株亲缘关系较远且处于不同的分支,确定10株分离毒均属ALV-J;对分离株与ALV-J参考株的3个主要基因gag、pol、env进行比对的结果显示,其gag和pol基因均比较保守,与参考株之间的相似性均在94%以上,而其囊膜蛋白env所表现的差异性则相对较大,相似性在90%～95%之间,进一步对env基因编码的两个结构蛋白gp85和gp37进行分析发现,gp37基因比较保守,分离株与ALV-J参考株之间的相似性较高(92.7%～99.0%),而分离株与参考株gp85之间的相似性差异较大(85.9%～96.0%)。由于gp85的序列决定着ALV亚群的分型,因此10株分离毒与ALV-J参考株gp85的相似性均比较高,而与其他亚群之间的相似性则低至38.1%～59.7%;对gp85的熵值分析显示,ALV-Jgp85的主要变异区域集中在hr1和hr2;对其LTR的分析显示,分离株与ALV-J参考株的LTR差异性也较大,相似性为87.0%～97.8%;进一步对LTR的U3区序列的分析显示,分离株与ALV-J参考株的相似性在86.3%～98.1%,且分离株GX17YL05、GX17NN06与ALV-J参考株GX14ZS04、GX14HG01及NHH在U3区均出现了 11个碱基的连续缺失,而另外8株分离毒均无11 bp的缺失。本研究对所得分离毒与ALV-J参考株序列比较发现,10株广西ALV-J毒株的基因序列整体变化不大。2014年本课题组从某育种公司使用的商品鸡新城疫-传染性支气管炎二联(新-支二联)商品活疫苗和鸡传染性喉气管炎(传喉)商品活疫苗分别分离鉴定到ALV-J毒株GX14YYA1和GX14YYD2。为探究免疫有外源性ALV污染的活疫苗对鸡群的致病性,本研究模拟疫苗在生产上的常规接种程序,分别进行了滴鼻和点眼1 d龄首免及7 d龄二免有ALV-J污染的新-支二联疫苗,1 d腹腔注射从传喉疫苗中分离纯化出来的ALV-J毒株GX14YYD2以及35 d龄点眼免疫污染有ALV-J的传喉疫苗,同时分别设置了无ALV-J污染的新-支二联疫苗和传喉疫苗的免疫对照组及空白对照组,所有鸡只在7 d龄进行ND、AIV-H5和AIV-H9油乳剂商品疫苗的免疫,分别在1d、1W、3W、4W、5W、8W、11W、15W、21W以及25W进行体重、病毒血症、病毒载量、抗体效价、体外排毒等相关指标的检测。结果显示,1d龄首免、7 d龄二免有ALV-J污染的新-支二联疫苗组和1 d腹腔注射从传喉疫苗中分离纯化出来的GX14YYD2组与两个对照组相比,鸡只受到了ALV的感染,表现体重显著降低(p≤0.05);免疫器官的正常发育和功能也受到显著影响,脾脏与对照组相比肿大(p≤0.05)、胸腺和法氏囊则都是萎缩的(p≤0.05),对常规油乳剂疫苗的免疫应答效果也显著降低(p≤0.05);鸡只的心脏出现了肉眼可见的ALV-J型血管瘤特征的血疱;而35 d龄免疫污染有ALV-J的传喉疫苗组和两个对照组在整个实验期内均没有临床发病,也没有检测到ALV病毒血症的存在。研究的结果证明,1 d龄首免、7 d龄二免有外源性ALV-J污染的新-支二联禽活疫苗,可以引起三黄鸡的感染并导致临床发病。本课题研究的结果说明,过去5年临床获得的10株ALV-J病毒的全基因序列整体变化不大,同时证明了免疫有外源性ALV-J污染的疫苗是其在商业鸡群中的传播途径之一。
【图文】：

粒子结构

子特异性的核酸酶Ｈ的活性，同时ｂ亚单位还有一个ＩＮ结构域即整合酶ｐ３２，病毒ＤＮＡ整合进宿主细胞染色体基因中具有重要的作用。逡逑襄膜蛋白基因ｍｖ与病毒的抗原性、组织亲嗜性以及毒力有关，对致肿起关键作用，同时也跟ＡＬＶ毒株的变异、感染宿主的范围［３８］以及致瘤的类型有编码ＳＵ表面蛋白和ＴＭ跨膜蛋白，这２种蛋白中较大的ＳＵ蛋白位于病纤突表面，呈球形，由ｇｐ８５基因编码，较小的ＴＭ蛋白将纤突与囊膜连接ｇｐ３７基因编码，这两种囊膜蛋白连在一起形成一个二聚体称为病毒糖蛋白。ｇｐ８５是ＡＬＶ亚群分类的主要依据也是病毒抗原的主要成分，当病毒欲侵入时ｇｐ８５则与靶细胞膜上的特异性受体识别后结合，而ｇｐ３７则主要负责将病靶细胞［４°］。对于ＡＬＶ－Ｊ来说，ｅｎｖ的变异将决定了不同ＡＬＶ－Ｊ毒株之间的毒力而不同ＡＬＶ－Ｊ邋ｅｎｖ基因之间的同源性也存在着很大的差异［４ｎ。ＡＬＶ病毒粒子图邋２－１。逡逑ＴＭ逦ＳＵ逡逑

模式图,病毒增殖,模式图,外源性

然后转录产物继续被加工后转运至细胞團，以ｍＲＮＡ的形式翻译产生ｅ？ｖ、／？0／、讲＾逡逑蛋白等，最后完成组装后从宿主细胞中释放出去，进一步加工成为具有感染性的病逡逑毒粒子［４２１，如图１－３。逡逑ｃ＃逡逑—ｚ－邋ａ逡逑ｌ邋Ｃｃｒ＾ｒ＜－：夕、＃逡逑一，逦ｒ，＊＂＂ｃ逡逑图１－３邋ＡＬＶ病毒增殖模式图逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＡＬＶ邋ｖｉｒｕｓ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ逡逑１．１．７外源性与内源性ＡＬＶ逡逑作为具有感染性病毒粒子进行传播的ＡＬＶ叫做外源性ＡＬＶ，邋ＡＬＶ－Ａ？Ｄ、Ｆ？Ｋ逡逑共１０个亚群均为外源性ＡＬＶ。外源性ＡＬＶ既可以水平传播也可以通过鸡胚将ＡＬＶ逡逑从父母代垂直传染给子代，，还可以以病毒粒子的形式进行传播％４３１。而内源性ＡＬＶ逡逑与外源性是相对的，内源性ＡＬＶ不以病毒粒子的形式进行传播，其本身就在鸡的体逡逑内存在并且可以整合到宿主细胞染色体中，通过孟德尔遗传定律进行垂直传播，内逡逑源性病毒粒子可能只是病毒基因组的完全或不完全片段［４４］。虽然内源性ＡＬＶ的致病逡逑性通常很弱或不具有致病性［４５］，不会引起鸡群肿瘤，但它们同样会表达ＡＬＶ的Ｐ２７逡逑蛋白基因
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.31

【参考文献】