自噬对DON诱导PC12细胞凋亡的保护作用及其信号转导机制

发布时间：2020-04-26 15:22

【摘要】：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又叫呕吐毒素,主要是由禾谷镰刀菌产生的一种霉菌毒素,世界范围内均有检出,广泛污染玉米、大麦、小麦等农产品及其制品。目前,对DON神经毒性的研究主要集中在神经细胞凋亡和组织坏死方面,而关于DON引起的神经损伤中是否有自噬的参与以及自噬的作用尚未见相关报道。本试验以PC12细胞作为研究对象,以不同浓度DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng/mL)处理24 h后,采用倒置显微镜、透射电镜、吖啶橙(acridine orange,AO)染色、单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin,MDC)染色和流式细胞术、GFP LC3质粒转染以及免疫荧光、荧光定量PCR、Western-blot等技术,研究DON对PC12细胞形态和超微结构、自噬泡、细胞凋亡率、LC3聚点率及自噬相关基因和蛋白Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(the class phosphatidylinositol 3Ⅲ-kinase,class PI3KⅢ)、人抑癌基因(Beclin-1)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、哺乳动物真核细胞胞质内调控蛋白(P62)、微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3)表达水平的影响。并且通过加入自噬特异性抑制剂(CQ)和激活剂(RAP),探究了自噬与凋亡的关系。结果显示:1.不同质量浓度DON作用PC12细胞24 h后,对照组细胞饱满,链接致密;处理组细胞之间空隙逐渐变大,丧失正常细胞的伸展形态,体积缩小渐为圆形,视野内漂浮和贴壁不紧的细胞增多。透射电镜观察到对照组细胞胞质均匀;DON处理组细胞质中有空泡,产生了双层或数层膜包裹的自噬小体和晚期自噬溶酶体结构,AO和MDC染色发现,对照组细胞胞浆和核仁显示绿色荧光,几乎无红色荧光,但DON刺激的细胞胞浆中的荧光点呈红色。常规状态下细胞MDC荧光强度较弱,伴随DON浓度的上升MDC荧光信号愈发明显,并有荧光积聚斑点。GFP-LC3转染发现,对照组GFP-LC3弥散分布于细胞中;自噬被诱导时,GFP-LC3大部分处于点状分布。2.各处理组细胞的凋亡率均随着DON浓度的增大而增大,极显著高于对照组(P0.01),在1000 ng/mL时达到峰值。在DON浓度达到2000 ng/mL时,坏死率增高。3.采用激光共聚焦显微镜观察LC3的聚点情况,对照组细胞呈微弱红色荧光,且LC3未成点状聚集;不同质量浓度的DON均可引起LC3发生聚点现象,在DON为1 000 ng/mL时发生LC3聚集的细胞数量最多。4.处理组细胞classⅢPI3K mRNA表达水平均极显著高于(P0.01)对照组,且在125~1 000 ng/mL,classⅢPI3K mRNA表达水平逐渐增高,于1 000ng/mL浓度时达到峰值,之后表达水平下降。Beclin-1 mRNA表达水平经DON刺激后极显著上升(P0.01),于1 000 ng/mL DON浓度组处于最大值。Bcl-2mRNA表达量随着DON浓度的增加而减低,大于250 ng/mL时表现为极显著降低(P0.01),于1000 ng/mL DON浓度时降至最低。LC3 mRNA表达水平随着DON质量浓度的增加而显著(P0.05)或极显著(P0.01)提高,在DON浓度为1000 ng/mL时达到峰值。P62 mRNA相对表达量随着DON质量浓度的升高而显著(P0.05)或极显著(P0.01)降低,在1 000 ng/mL DON时降至最低。另外,与1000 ng/mL DON相比,1000 ng/mL DON+PI3K抑制剂LY294002处理组classⅢPI3K、Beclin-1、LC3 mRNA表达水平均极显著降低(P0.01),而Bcl-2、P62 mRNA表达水平明显的升高。5.与对照组比较,classⅢPI3K蛋白表达水平在超过250 ng/mL时显著(P0.05)或极显著升高(P0.01),并随着DON浓度的增加而升高,在1000 ng/mL时达到最大值;Beclin-1蛋白表达水平极显著升高(P0.01),同样也在1000ng/mL时达到峰值。LC3蛋白表达量在超过250 ng/mL时显著(P0.05)或极显著增加(P0.01),在1000 ng/mL时达到最大值;Bcl-2、P62蛋白表达量均极显著的减少(P0.01),在1000 ng/mL时降到最低。另外,与1000 ng/mL DON处理组相比,1000 ng/mL DON+LY294002处理组classⅢPI3K、Beclin-1、LC3蛋白表达水平均极显著降低(P0.01),而Bcl-2、P62蛋白表达水平明显升高。6.与1000 ng/mL DON处理组相比,1000 ng/mL DON+CQ的LC3Ⅱ蛋白表达水平极显著升高(P0.01)。125 ng/mL DON处理组与125 ng/mL DON+RAP处理组相比,125 ng/mL+RAP LC3Ⅱ蛋白表达量极显著上升(P0.01)。7.与对照组相比,各处理组细胞凋亡率均显著(P0.05)或极显著升高(P0.01)。125 ng/mL DON+RAP处理组与125 ng/mL DON处理组相比,凋亡率极显著下降(P0.01),1000 ng/mL DON+CQ处理组与1000 ng/mL DON处理组相比,凋亡率极显著上升(P0.01)。综上所述:DON能够诱导PC12细胞产生凋亡和自噬,自噬相关基因和蛋白classⅢPI3K、Beclin-1、Bcl-2、P62、LC3参与了DON诱导PC12细胞自噬的调控。CQ抑制了DON诱导PC12细胞产生自噬的进程,RAP能够使自噬表达水平上调。使用流式细胞仪测定凋亡率来反映其中的联系,结果表明自噬的减弱会促使PC12细胞的凋亡率增加。
【图文】：

PC12细胞,细胞,视野

2 结果与分析2.1 DON 对 PC12 细胞形态的影响分别用配制好的不同质量浓度的 DON 处理 PC12 细胞 24 h 后，倒置显微镜下观察细胞的生长情况，结果表明，对照组（0 ng/mL DON）PC12 细胞饱满，细胞充满整个视野，紧密的链接在一起，甚至出现接触抑制现象（图 2-1-A）；DON 处理组随着 DON 质量浓度的升高，PC12 细胞之间空隙逐渐变大，，凸起结构逐渐变少，丧失正常细胞的饱满伸展形态，体积缩小渐为圆形，视野内漂浮和贴壁不紧的细胞增多（图 1-B, C, D, E, F）。

自噬泡,细胞凋亡,自噬,自噬体

26图 2-2 DON 对 PC12 细胞凋亡的影响Fig2-2 Effect of DON on apoptosis in PC12 cells注：A. 细胞凋亡图；B. DON 对 PC12 细胞凋亡的影响。**P < 0.01 表示与对照组相比差异极显著。Note: A. Apoptosis picture; B. Effects of DON on apoptosis in PC12 cells. **P < 0.01 shows significantdifferences compared with the control group.2.3 AO 染色观察 DON 对酸性自噬泡的影响自噬的形态特征是自噬体的累积，也叫做自噬泡。对照组细胞经 AO 染色后胞浆和核仁显示绿色荧光，几乎无红色荧光，但 DON 处理中细胞胞浆中的荧光点呈红色。终浓度为 0、125、250、500、1000、2000 ng/mL 的 DON 处理 PC12
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S859.8

【参考文献】