贝莱斯芽孢杆菌A2对玉米赤霉烯酮降解机制及其安全性评估

发布时间：2020-04-26 18:03

【摘要】：玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一种具有类雌激素特征的镰刀菌次生代谢产物。ZEN在谷类作物中的污染十分普遍,其在谷类农产品中的残留对动物造成了巨大的危害。在ZEN脱毒策略中,物理和化学方法在生产成本、营养价值和适口性方面存在一定的限制。近年来,生物脱毒法因其特异性高、脱毒效率高、脱毒后的产物无毒等优点,已经成为ZEN脱毒的研究热点。本研究旨在寻找一种能够高效降解ZEN的菌株,探讨其对ZEN的降解特性、降解产物及降解机制,并通过动物安全性试验评估降解菌株饲用的潜在价值。论文主要研究内容和结果如下:试验一ZEN高效降解菌株的筛选和鉴定以ZEN作为唯一碳源,通过HPLC检测从土壤中筛选出9株对ZEN的降解率在50%以上的菌株,最终选取在LB培养基中发酵3d对ZEN(7.45μg/mL)的降解率高达100%的A2菌株。通过形态学观察和16S rRNA基因序列比对分析显示A2菌株是Bacillus velezensis。试验二Bacillus velezensis A2对饲料中ZEN的脱毒效果及其对ZEN降解产物的初探150g ZEN(60mg/kg)污染饲料与150mL无菌蒸馏水混合接入5mL培养24h的A2菌株,在恒温震荡器内以150rpm、37℃孵育5d(发酵过程中ZEN浓度为60μg/mL),经HPLC检测后发现无ZEN的残留。结果表明Bacillus velezensis A2同样适用于饲料中ZEN的发酵脱毒。将培养24h的A2菌株发酵液的不同成分分别与ZEN共同孵育48h,通过HPLC定位A2菌株降解ZEN的功能物质;将PBS重悬的A2菌体与ZEN共同孵育,收集不同时间段的孵育样品,使用Agilent 1100 Series LC/MSD Trap系统分析ZEN降解产物。结果显示,菌株胞外液、胞内液及活菌体对ZEN脱毒作用较强,而灭活菌株没有作用;同时检测到分子量m/z=295.0[292+3H]~+的ZEN内酯环水解脱羧产物。该试验初步的研究结果证明,Bacillus velezensis A2分泌的活性物能够有效降解ZEN,ZEN内酯环水解脱羧是其主要脱毒机制。试验三评估Bacillus velezensis A2在ZEN脱毒过程中的安全性将昆明小鼠(n=40)随机分配到对照组(K)、ZEN毒素组(ZEN)、A2菌株组(A2)和解毒组(A2+ZEN)。用A2菌株的LB发酵液作为ZEN(ZEN 40mg/kg BW)解毒剂管饲小鼠。试验周期为28d,试验结束后,收集血液、脏器组织做相应的检测。组织病理学分析结果显示,A2发酵液的口服管饲降低了由ZEN诱导的肾脏损伤程度;试剂盒检测结果显示,A2发酵液还大大降低了ZEN所引起肌酐(CRE)、尿酸(UA)和尿素氮(BUN)血清水平的增加。另外,A2发酵液的管饲逆转了由ZEN诱导的肾组织中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的降低,以及超氧化物歧化酶(MDA)含量的增加;RT-PCR和Western Blot分析结果表明,ZEN的饮食不仅提高了小鼠肾组织中内质网应激关键基因BiP相关mRNA和蛋白的表达量(p0.05),还提高了促凋亡基因JNK、Caspase-12、CHOP相关mRNA和蛋白的表达量(p0.05)。此外,ZEN的饮食使得小鼠肾脏中抑凋亡基因Bcl-2相关mRNA和蛋白的表达量显著降低,同时诱导了P-JNK和Anti-DDIT3蛋白的表达。然而,A2发酵液的管饲显著逆转了这些基因在肾组织中的异常表达。该试验结果证明,口服Bacillus velezensis A2发酵液能够缓解ZEN对小鼠肾脏的氧化损伤和细胞凋亡。结论:本试验筛选出的Bacillus velezensis A2是一株未被发表的ZEN降解菌,该菌分泌的活性物质催化ZEN内酯环水解脱羧是其主要降解机制,且该菌株发酵液的口服能够缓解ZEN对小鼠肾脏的损伤作用。Bacillus velezensis A2用于霉菌毒素脱毒具有较好的开发潜力。
【图文】：

图 1-1 玉米赤霉烯酮及其衍生物的结构式Fig.1-1 Structural formulas of zearalenone and its derivatives赤霉烯酮在体内的吸收代谢被动物摄入体内后，会被肠道微生物及胃肠黏膜细胞进行生物转化源性物质结合，然后通过血液运输到机体各处。经放射性标记法收代谢类似的是，ZEN 也要经过肠-肝循环，ZEN 的代谢主要发、睾丸等具有雌激素靶器官的组织中。研究发现，在胃肠道内代谢产物可以附着在未消化的饲料纤维上，以粪便形式排出体外；乳动物排出的乳汁和尿液中（Dong M, et al，2010；Ji J, et al，20要有两种代谢途径：一种是吸收后的 ZEN 在体内被 3α-/3β-羟基生成玉米赤霉烯醇（包括α-、β-ZOL），并进一步催化还原成玉米EL），这些代谢产物都具雌激素样作用效果（Kowalska K, et al，ZEN 及其衍生物通过与动物体内的二磷酸尿苷葡萄糖苷转移酶或为无毒的葡萄糖醛酸和硫酸盐的代谢物（Binder SB, et al，2017；

第二章 玉米赤霉烯酮高效降解菌 A2 的分离和鉴定PCR扩增产物的完整性，并将完整的PCR扩增产物送至上海AST比对分析，根据比对结果从Gen Bank数据库中下载的公认标准序列，，使用DNAStar把下载菌株序列和测试菌lustal W构建菌株的系统发生树及同源性矩阵图。与分析曲线绘制结果曲线如图2-1所示，ZEN的浓度在0.391~25.0μg/mL范围内呈004x-0.2033，相关系数为R2=0.9999。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S859.8

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本文编号：2641750