猪瘟和口蹄疫病毒结构蛋白转基因奶山羊的制备

发布时间：2020-04-28 08:43

【摘要】：猪瘟和口蹄疫分别感染猪和偶蹄动物,传播范围广,危害大,造成了严重的经济损失。当前主要采用病毒弱毒苗和灭活苗防控,但是两者都有一定的缺陷,所以研发一种抗猪瘟和口蹄疫病毒的基因工程亚单位疫苗十分必要。研究发现,猪瘟病毒结构蛋白E0、E2和口蹄疫病毒结构蛋白中的VP1蛋白能够诱导动物体内产生针对病毒的中和抗体。因此,本实验利用慢病毒转基因技术,制备猪瘟和口蹄疫病毒重要结构蛋白奶山羊乳腺生物反应器。构建了猪瘟病毒结构蛋白E0、E2和口蹄疫病毒结构蛋白(VP1蛋白)外源基因的慢病毒表达载体,包装病毒颗粒,转染山羊乳腺上皮细胞验证猪瘟病毒结构蛋白E0、E2和口蹄疫病毒结构蛋白(VP1蛋白)在宿主细胞内的表达;用慢病毒感染胚胎,制备转基因羊,获得如下结果:1.利用PCR技术克隆了CSFV-E0、CSFV-E2、AFMDV-VP1、OFMDV-VP1目的基因,并在5’端加His-Flag标签;克隆两个乳腺特异性的BLG启动子,分别为BLG5和BLG11;利用上述元件构建出乳腺特异性的慢病毒载体PCDH-BP5/11-CSFV-E2、PCDH-BP5/11-CSFV-E0、PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1、PCDH-BP5/11-OFMDV-VP1双酶切鉴定验证了载体构建成功。2.将慢病毒包装质粒PMD2G、PSPAX和慢病毒载体质粒PCDH-BP5/11-CSFV-E2、PCDH-BP5/11-CSFV-E0、PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1、PCDH-BP5/11-OFMDV-VP1共转293T细胞,得到了带有目的基因的慢病毒,感染乳腺上皮细胞,RT-PCR和Western blotting检测到乳腺上皮细胞上清中有CSFV-E2、CSFV-E0、AFMDV-VP1和OFMDV-VP1的表达。3.利用超数排卵技术,获得山羊受精卵180枚,将病毒液注射到受精卵透明带间隙,选择存活的胚胎149枚,移植受体50只,获得后代35只,经PCR鉴定,获得PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1转基因羊4只,PCDH-BP5/11-OFMDV-VP1转基因羊6只,PCDH-BP5/11-CSFV-E0转基因羊3只,PCDH-BP5/11-CSFV-E2转基因羊3只。
【图文】：

恒温摇床 上海福玛实验室设备有限公司 China2.1.3 载体和菌株如图2-1所示慢病毒骨架载体PCDH-CMV-EF1-copGFP，质粒PMD-18T构自TaKaRa公司，E.coli Trans5α 感受态细菌，慢病毒包装质粒 PMD2G、PSPAX 本实验室保存有，293T 细胞本实验室保存。9

用Cla I和Sal I酶切PCDH-BP5/11-CSFV-E0、PCDH-BP5/11-CSFV-E2、PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1、PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1质粒，琼脂糖凝胶电泳检测到基因条带（图2-5），载体酶切结果与预期一致。切胶回收，送测序，比对测序结果，序列一致表明重组慢病毒穿梭载体构建成功。19
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】

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本文编号：2643274