不同基因型新城疫病毒对鹌鹑的致病性及TLRs信号通路相关因子表达差异研究

发布时间：2020-04-30 07:22

【摘要】：新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒株引起的一种急性、烈性传染性疾病。近年来,该病已成为危害鹌鹑养殖业的主要疫病之一。我国多个省份已有该病暴发和流行的报道,在经济上给鹌鹑养殖业造成重大的损失。本研究根据GenBank上发表的不同禽类Toll样受体信号通路中部分固有免疫相关因子(TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9)及内参基因(β-actin)的序列并参阅相关文献报道,设计并合成7对特异性引物。利用合成的引物通过PCR方法扩增出目的片段,然后进行基因克隆,构建质粒标准品,建立检测上述基因的荧光定量PCR方法(qRT-PCR),进行特异性和重复性试验。结果表明,建立的TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9和β-actin实时荧光定量PCR标准曲线的线性相关系数在0.99～1.00之间、扩增效率在1.83～2.13之间且溶解曲线在40个循环内呈现单一溶解峰。重复性检验结果中各目的基因批内和批间变异系数都小于4.0%,标准差小于0.5。上述结果证明建立的qRT-PCR检测方法具有特异性强、稳定性和可重复性高的特点,为定量分析鹌鹑固有免疫相关因子mRNA转录水平提供了技术支持。为探究不同基因型NDV对鹌鹑的致病性差异,本课题选用基因Ⅶ型GXQ53毒株、基因Ⅷ型GXGF12001毒株和基因Ⅸ型F48E8国内参考毒株人工感染35日龄的非免疫鹌鹑,观察、记录试验动物临床症状并打分,在感染后5、8、11天观察各试验组鹌鹑的脾脏、大脑和盲肠扁桃体的病理学变化并记录得分;采集组织样品进行病理组织学观察、病毒载量测定和0固有免疫相关因子基因表达量的测定。具体结果如下:(1)感染组均表现出典型的新城疫临床症状和剖检病变,其中F48E8组、GXGF12001组、GXQ53组临床症状得分分别为12.0分、6.0分和6.0分,剖检病变平均得分分别为3.0分、1.67分和1.83分。病理组织学检测结果表明,F48E8、GXGF12001和GXQ53毒株对脾脏、盲肠扁桃体和脑均能产生不同程度的损伤,其中脾脏和盲肠扁桃体两个免疫器官均表现出淋巴细胞减少、出现坏死灶,随着感染时间增加F48E8组和GXGF12001组病变加剧,而GXQ53组有逐渐转归的迹象。而大脑的病变以小胶质细胞增生为主,随着时间推移病变都有加剧的趋势。综合病理组织结果来看,F48E8对免疫系统和神经系统的损伤能力比GXGF12001的强,而GXQ53组弱于前两组。(2)试验组鹌鹑的脾脏、盲肠扁桃体和大脑中病毒载量检测结果表明,F48E8毒株和GXGF12001毒株不仅可在脾脏和盲肠扁桃体中复制,还可以通过血脑屏障浸染到大脑中。而GXQ53毒株只在盲肠扁桃体中复制。病毒拷贝数显示脾脏中GXGF12001毒株的复制能力强于F48E8毒株,而F48E8毒株在脑中的复制能力强于GXGF12001毒株。盲肠扁桃体中复制能力强弱顺序为:GXGF12001毒株F48E8毒株GXQ53毒株。(3)鹌鹑感染NDV后不同组织中固有免疫相关因子的相对表达量结果如下:TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9在脾脏、大脑和盲肠扁桃体中都有表达。其中,TLR3、IL-6和IL-8在脾脏中表达显著上调(P0.05),盲肠扁桃体中TLR7、IL-8、AvBD-9和IL-6表达显著上调(P0.05),脑中IFNα和AvBD-9显著上调(P0.05),且这些组织中细胞因子的相对表达量与病毒的拷贝数趋于正相关。综上所述,我们推测TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9可能参与鹌鹑对NDV感染的免疫反应。本课题成功建立了检测鹌鹑固有免疫相关因子TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9和内参基因β-actin荧光定量方法;人工感染试验表明基因Ⅶ型GXQ53毒株、基因Ⅷ型GXGF12001毒株和基因Ⅸ型F48E8毒株对非免疫鹌鹑具有组织嗜性,病毒可在脾脏、盲肠扁桃体和大脑中增殖并对这些组织器官造成损伤,且F48E8毒株的致病性强于GXGF12001毒株,而GXQ53毒株的致病性最弱,它们都能引起鹌鹑的发病死亡。由所检测的细胞因子mRNA结果推测TLR3、TLR7、IL-8、IFNα在鹌鹑脾脏、脑和盲肠扁桃体中可能参与鹌鹑对新城疫病毒感染的免疫反应,而IL-6在脾脏和盲肠扁桃体中表达量显著上调,以及AvBD-9在脑中的表达量显著上调,可能与TLR7介导的MyD88依赖途径以及TLR3介导的TRIF依赖途径有关。
【图文】：

路传递到下游引起ＩＲＦ７、ＮＫ－ｋＢ和ＡＰ－１信号通路激活，从而诱导炎性细胞因子的产生逡逑［６６］，如图１－２。现今ＮＤＶ为仅次于禽流感病毒是养禽业的第二大疾病被作为重点研宄逡逑对象之一。关于ＴＬＲｓ在禽类感染ＮＤＶ后细胞因子的变化有一定的研究。逡逑Ｌｉ等研宄表明鸽子感染ＰＰＭＶ－１病毒后能够引起部分先天性免疫相关因子的表达逡逑量发生上调，特别是ＴＬＲ３和ＴＬＲ７在多个组织器官中表达上调［６７］。逡逑Ｄｅｉｓｔ等研究发现鸡感染ＮＤＶ后使用转录组的方法显示感染后气管中免疫细胞浸逡逑润增加，ｉＣＯＳ－ｉＣＯＳＬ信号传导，ＮＦ－ｋＢ信号传导，先天免疫因子不同程度的表达［６８］。逡逑Ｒｕｅ等分别用毒力不同的Ｎ邋ＤＶ感染鸡，发现强毒株可引起鸡脾脏中的炎性因子逡逑（ＩＦＮａ、ＩＬ－６）表达上调，而弱毒株引起的变化不明显逡逑徐倩倩等川鹅源新城疫感染鹅发现感染７２小时后病母复制与ＴＬＲ１－５和ＴＬＲ７、逡逑ＡｖＢＤ－４，６，１０和１２、ＭＨＣ邋Ｉ类、ＦＡＳ配体和ｉＮＯＳ的宿主ｍＲＮＡ表达之间呈正相关ｌ？］。逡逑７逡逑

以鹌鹑外周血获得的ｃＤＮＡ为模板，使用合成的７对特异性引物按照２．２．２．３中的逡逑反应体系和反应程序进行ＰＣＲ扩增。用ＤＬ５００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ为参照与获得的ＰＣＲ产物逡逑—同进行２．０％的琼脂糖凝胶电泳，利用紫外凝胶成像仪查看扩增结果。结果（如图２－１）逡逑表明获得与预期大小相符的ＤＮＡ片段。逡逑Ｍ邋１逦２逦３逦４逦５逦６逦７逡逑图２－１鸫鹑不同细胞因子的ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果图逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋Ｑｕａｉｌ邋ｃｙｔｏｋｉｎｅ邋ＲＴ－ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ逡逑Ｍ：ＤＬ５００；邋ｌ：ｐ－ａｃｔｉｎ；邋２：ＴＬＲ３；邋３：ＴＬＲ７；邋４：邋ＩＦＮａ；邋５：ＡｖＢＤ－９；邋６：ＩＬ－８；邋７：ＩＬ－６；逡逑１５逡逑
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

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本文编号：2645534