鸡伤寒沙门菌1009ΔspiCΔcrp减毒株的构建及其安全性和免疫效力研究
发布时间：2020-05-01 03:12
【摘要】：禽伤寒(fowl typhoid)是因感染鸡伤寒沙门菌(.Salmonella Gallinarum)而导致的急性或慢性败血性禽类传染病,表现出腹泻、厌食、精神不振等症状,给养禽业造成巨大的经济损失。该病可通过药物进行治疗,虽然减少了死亡,但长期用药会增加成本,易产生耐药性,且愈后带菌,因此,免疫接种仍是预防和控制该病的一个理想选择。最先被用于控制禽伤寒的减毒活疫苗9R,能有效的抵抗鸡伤寒沙门菌的感染,但其残留的毒力仍有致病性。因此,研制一种安全有效的鸡伤寒沙门菌减毒疫苗仍将十分必要。本研究利用自杀质粒介导的同源重组技术构建出鸡伤寒沙门菌1009株的spiC基因缺失株1009ΔspiC,在此基础上,运用λ噬菌体同源重组系统进一步敲除crp基因,构建出鸡伤寒沙门菌1009ΔspiCAcrp双基因缺失株。PCR和测序鉴定结果表明,成功获得鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspiCΔcrp。生物学特性研究结果显示,1009株spiC和crp基因的缺失能够得到稳定的遗传,缺失株部分生化特性发生了变化,生长速度减慢,与野生株相比其对雏鸡的LDso升高了107倍,表明双基因的缺失使鸡伤寒沙门菌1009ΔspiCΔcrp的毒力减弱。为评价1009ΔspiCΔcrp减毒株的安全性及保护效力,本实验采用肌肉注射的方式分别以1×105CFU、1×106CFU、1×107CFU的剂量对3日龄雏鸡进行初次免疫并于1周后再次免疫,同时对照组用PBS以相同方式进行免疫。体重测定以及临床观察结果显示其与对照组没有差别,表明减毒株对雏鸡的生长没有影响且不会出现副作用,细菌在肝脏和脾脏中短暂定殖后可被机体清除。血清IgG抗体水平和淋巴细胞增殖的检测结果表明,肌肉注射免疫后减毒株诱导雏鸡产生了良好的细胞免疫和体液免疫应答。免疫后21天,攻毒保护效力结果显示免疫组在攻毒后没有出现临床症状,免疫保护率为100%。另外,本研究以1009ΔspiCΔcrp减毒株口服免疫雏鸡后,对减毒株的安全性和免疫效力进行了初步研究。在对3日龄雏鸡进行口服免疫并于1周后进行再次免疫后,免疫组雏鸡体重增长与对照没有显著差异；产生了较高的IgG抗体水平,并于初次免疫3周后达到最高且显著高于对照组；IL-4、IL-6和IL-1p的表达水平也出现上调。在初次免疫后21天用强度株SG9攻毒后免疫组的保护率为100%,而对照组则为30%。同时组织病理切片也显示,免疫组无病变而对照组脏器病变明显。结果表明,1009ΔspicAcrp具有良好的安全性并能诱导雏鸡产生有效的免疫应答,是理想的防治鸡伤寒的疫苗候选株,为实现在实际生产中使用疫苗来预防并控制鸡伤寒奠定了基础。
【图文】：
２．１鸡伤寒沙口菌１０0９Ａｗｚ’ａＫｍＫ的筛选及鉴定逡逑挑取经电转化含有自杀质粒的扔２１３邋（ＰＧＭＢ１５１－Ａ５内Ｃ／＾Ｋ）单菌落，引物Ｗｚ’Ｃ－逡逑ＹＺ－Ｆ／民进斤ＰＣＲ验证，扩增出约２．０邋Ｉｃｂ的条带（图１－１），表明自杀质粒ｐＧＭＢ１５１－逡逑Ａｗｚ’Ｃ／ＫｍＫ成功转入的２１３，可做为供体菌与受体菌进行接合转移。鸡伤寒沙口菌１００９逡逑株与Ｘ７２１３邋（ＰＧＭＢ１５１－Ａ５知Ｃ／ＫｈｉＫ）混合培养进行固相杂交，发生接合转移后，重组质逡逑粒ＰＧＭＢ１５１－Ａ却Ｃ／ＫｍＫ的同源臂与染色体上如Ｃ基因的同源序列发生交换，将被整合逡逑到染色体上，此时重组菌存在ＷＺＣ的两种拷贝形式，，即缺失型和野生型。因此，Ｗ上游逡逑内部序列和下游内部序列组成的验证引物Ｗ／Ｃ－ＹＺ－Ｆ／Ｒ进行ＰＣ民验证，会扩X棾隽教醮义咸醮笮》直鹪迹玻板澹耄夂停保板澹祝浚ㄍ迹保玻Ｌ羧〗雍献蒲橹ふ返木辏谖蓿危幔茫旌义希保埃ナ堑模蹋乱禾迮嘌写写嘌⒕剐陨秆『蠡竦茫保埃埃梗粒鳎茫耍恚巳卞义鲜е
本文编号：2646488
【图文】：
２．１鸡伤寒沙口菌１０0９Ａｗｚ’ａＫｍＫ的筛选及鉴定逡逑挑取经电转化含有自杀质粒的扔２１３邋（ＰＧＭＢ１５１－Ａ５内Ｃ／＾Ｋ）单菌落，引物Ｗｚ’Ｃ－逡逑ＹＺ－Ｆ／民进斤ＰＣＲ验证，扩增出约２．０邋Ｉｃｂ的条带（图１－１），表明自杀质粒ｐＧＭＢ１５１－逡逑Ａｗｚ’Ｃ／ＫｍＫ成功转入的２１３，可做为供体菌与受体菌进行接合转移。鸡伤寒沙口菌１００９逡逑株与Ｘ７２１３邋（ＰＧＭＢ１５１－Ａ５知Ｃ／ＫｈｉＫ）混合培养进行固相杂交，发生接合转移后，重组质逡逑粒ＰＧＭＢ１５１－Ａ却Ｃ／ＫｍＫ的同源臂与染色体上如Ｃ基因的同源序列发生交换，将被整合逡逑到染色体上，此时重组菌存在ＷＺＣ的两种拷贝形式，，即缺失型和野生型。因此，Ｗ上游逡逑内部序列和下游内部序列组成的验证引物Ｗ／Ｃ－ＹＺ－Ｆ／Ｒ进行ＰＣ民验证，会扩X棾隽教醮义咸醮笮》直鹪迹玻板澹耄夂停保板澹祝浚ㄍ迹保玻Ｌ羧〗雍献蒲橹ふ返木辏谖蓿危幔茫旌义希保埃ナ堑模蹋乱禾迮嘌写写嘌⒕剐陨秆『蠡竦茫保埃埃梗粒鳎茫耍恚巳卞义鲜е
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