宿主因子SGTA通过与流感病毒M2蛋白互作促进病毒复制

发布时间：2020-05-01 13:28

【摘要】：流感病毒是引起人类流行性感冒的病原体。近年来随着流感病毒的流行,新的变异株不断产生,宿主范围不断扩大,病毒的致病性和传播能力也有不断增强的趋势,对公共卫生安全的危害日趋严重。流感病毒结构简单,基因组较小,可以通过移码及可变剪接等方式表达多种蛋白,但在宿主体内,仍需要借助宿主的蛋白质合成及运输系统、能量系统和可变剪接系统等完成自身的复制。另一方面,流感病毒入侵宿主后,可以被宿主的免疫系统识别,宿主免疫相关蛋白可以通过与病毒蛋白的相互作用,限制流感病毒的复制。由此可见流感病毒与宿主的相互作用是一个非常复杂的过程,深入研究宿主蛋白与流感病毒蛋白的相互作用,对于理解流感病毒的复制机制和致病机理,从而实现流感的有效防控至关重要。流感病毒M2蛋白是一个多功能的蛋白分子,它的离子通道活性可以在病毒复制早期介导病毒脱壳从而使核糖核蛋白复合体(vRNP)具备入核能力,也可以在反式高尔基体中协助HA蛋白成熟。另外,M2蛋白在病毒复制后期促进子代病毒粒子出芽释放。鉴于M2蛋白在流感病毒复制周期中具有重要作用,本实验室前期利用酵母双杂交系统筛选与M2蛋白相互作用的宿主因子,其中之一为Small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing proteinα(SGTA)。本研究通过酵母回交验证表明SGTA蛋白与M2蛋白可以在酵母系统中发生相互作用,免疫共沉淀实验证实M2蛋白与SGTA在293T细胞中存在互作,进一步研究发现SGTA蛋白C端91-313位氨基酸是与M2蛋白互作的关键区域。激光共聚焦实验结果显示外源转染的SGTA蛋白和M2蛋白主要共定位于细胞质内。过表达SGTA蛋白可以促进流感病毒复制,而siRNA下调SGTA蛋白表达或CRISPR-Cas9敲除SGTA后则显著抑制流感病毒复制,由此可见,SGTA蛋白对流感病毒复制发挥正调控作用。在此基础上,我们发现siRNA干扰下调表达SGTA后不影响病毒NP蛋白进入细胞核,表明SGTA蛋白不影响流感病毒早期复制。重要的是,我们发现SGTA蛋白可以增加M2蛋白的稳定性,随着SGTA蛋白转染量的增加M2蛋白表达呈递增趋势。本研究部分阐明了宿主蛋白SGTA通过与流感病毒M2蛋白互作正调控流感病毒复制的机制,丰富了流感病毒与宿主相互作用的网络。
【图文】：

回交,酵母,相互作用,酵母菌

验证 pGBKT7 和 pGADT7，阴性对照组 pGBKT7-Lamin 和 pGADT7和 pGADT7-T 以及重组阳性质粒 pGADT7-SGTA 和诱饵质粒 pGBY2H Gold 感受态细胞，并涂在 SD/-2、SD/-4 和 SD/-4/X/A 三种缺验证。结果显示，空白对照 pGBKT7 和 pGADT7 与阴性对照 p化后的酵母菌可以在 SD/-2 平板上生长，但不能在 SD/-4 和 SD/-4/照 pGBKT7-p53 和 pGADT7-T 转化后的酵母菌能在 SD/-2、SD/-4正常生长，而且能分解 SD/-4/X/A 缺陷平板上的 X-α-Gal 底物，。重组阳性质粒 pGADT7-SGTA 和诱饵质粒 pGBKT7-M2 共转的D/-4/X/A 三种缺陷平板上生长，而且也可以分解 SD/-4/X/A 缺陷平板，与阳性对照组一致（图 2.1），说明 SGTA 蛋白与 M2 蛋白在酵

相互作用,蛋白

科学院硕士学位论文第二章宿主蛋白 SGTA 与流感病毒 M2 蛋白相互作疫共沉淀检测 M2 蛋白与 SGTA 蛋白相互作用 M2 蛋白及 SGTA 蛋白真核表达质粒单独转染或共同转染 HEK293T 细胞，并在转胞，留取对照样品后，在其余样品中加入 Flag 抗体进行 IP。结果显示，Flag-MTA 质粒均能正常表达，，而且用 Flag 抗体可以将 SGTA 蛋白 IP 出来（图 2.2）， SGTA 蛋白在哺乳动物细胞中存在特异性相互作用。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

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