截短NSP2的真核表达及其在PRRSV复制中的作用研究

发布时间：2020-05-01 14:48

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)世界各国流行,是养猪业危害最严重的疾病之一。其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)属于套式病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)成员之一,基因组为单股正链RNA,至少具有10个ORFs,即ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-7,及ORF5a基因。ORF1编码所有非结构蛋白,已知有14个非结构蛋白NSP1α、Nsp1β、Nsp2-6、Nsp7α、Nsp7β、Nsp8-12。Nsp2是PRRSV编码的多功能蛋白,包括半胱氨酸酶区、高变区、跨膜区,Nsp2在PRRSV的复制、致病中具有重要的生物学意义。本研究开展了2016-2017年间贵州省临床病料PRRSV NSP2检测、分析了2017年临床毒株GZ-R全长NSP2序列特征、构建了截短NSP2的真核表达载体、分析了截短NSP2在HEK293细胞中的表达、初步探索了截短NSP2在PRRSV复制中的作用,旨在为了解我省PRRSV流行情况、探索PRRSV的致病机理奠定基础。1.PRRSV临床病例诊断。对2016-2017年收集的临床病例样本进行临床症状与剖解观察、病理组织学观察、运用世纪元亨公司的PRRSV检测试剂盒进行PRRSV NSP2的RT-PCR检测。结果送检病猪主要表现呼吸困难、皮肤发绀,肺与脾脏组织可见大量淋巴细胞浸润、肺泡间隔增厚,肺呈弥漫性间质性肺炎。从24份疑似PRRSV病料样本中,有8份样本PRRSV NSP2的RT-PCR检测为阳性,阳性率为33.3%(8/24)。2.贵州流行PRRSV毒株GZ-R NSP2序列分析。运用分子生物学方法,对PRRSV阳性样本GZ-R的全长NSP2进行序列扩增、TA克隆、测序,采用DANSar、NCBI在线软件对获得序列进行分析。结果(1)获得携带GZ-R NSP2全长序列的pMD18T-GZ-R-NSP2-L质粒、携带GZ-R-NSP2小片段的pMD18T-GZ-R-NSP2-S质粒。测序结果发现,GZ-R NSP2全长(GZ-R-NSP2-L)为2980bp,编码993个氨基酸;GZ-R NSP2小片段(GZ-R NSP2-S)为1131bp,编码377个氨基酸。GZ-R NSP2小片段具有大片段N端1-945bp与C端2795-2980bp序列,缺失GZ-R NSP2大片段的956-2794bp的序列,很可能是一种新的NSP2亚型。(2)GZ-R NSP2全基因氨基酸同源性结果分析表明,GZ-R株NSP2基因编码氨基酸与22株参考毒株的同源性为24.3%~99.0%,与美洲性毒株同源性为54.1%~99.0%。GZ-R株NSP2基因与美洲型经典代表株ATCC VR-2332同源性分别为77.1%,与我国高致病性毒株HUN4、JXA1的同源性为98.4%和98.5%,与NJ-1106株的氨基酸序列同源性最高,为99.0%。进一步与ATCC VR-2332、CH-1a、HUN4、JXA1毒株进行氨基酸序列比对发现,GZ-R的NSP2基因的有1+29+1个氨基酸缺失,缺失位置与高致病性PRRSV JXA1和HUN4的缺失位置一致。3.截短NSP2真核表达载体的构建与表达分析。运用常规分子生的学方法以携带NSP2全长质粒pcDNA 3.1-5’Flag-NSP2-TL模板构建截短NSP2真核表达质粒,采用脂质体2000将截短NSP2真核表达质粒转染至HEK23细胞,分析截短在细胞中的表达情况。结果:(1)经PCR、测序、酶切、IFA试验鉴定,成功构建了截短Nsp2的真核表达载体,pcDNA3.1-NSP2-147~323aa与pcDNA3.1-NSP2-47-323aa;(2)IFA试验结果表明,无论用标签Flag抗体还是特异性NSP2单抗均可检测到重组蛋白pFlag-Nsp2-147-323aa、pFlag-Nsp2-47-323aa在HEK293细胞中的表达,pFlag-Nsp2-147-323aa、pFlag-Nsp2-47-323aa在细胞浆、细胞核中均有表达。4.截短Nsp2在PRRSV复制中的作用研究。采用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-NSP2-147-323aa、pcDNA3.1-NSP2-47-323aa组与空载体转染至Marc145细胞,转染24 h后感染PRRSV,感染24 h后收集上清测TCID50值。结果pcDNA3.1-NSP2-147-323aa、pcDNA3.1-NSP2-47-323aa组与空载体组的TCID50值差异不显著。Marc145是PRRSV的易感宿主细胞,但该细胞的转染与表达效率低可能是造成试验结果差异不显著的原因。
【图文】：

发病猪临床外观Figure1-1theclinicalappearanceofswine

部分解

图 1-2 发病猪部分解剖图Figure 1-2 partial dissection of swine3.3 RT-PCR 结果以 2016-2017 年间收集到的疑是 PRRSV 24 份病料组织提取总 RNA 作为模板，经逆转录合成 cDNA，并将反转录生成的 cDNA 进行 PCR 扩增，其扩增的结果见下图。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651

【参考文献】