毒害艾美耳球虫子孢子cDNA文库筛选及SNF2基因克隆表达与功能研究

发布时间：2020-05-07 02:54

【摘要】：毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)是7种鸡球虫中致病性最大的虫种之一,主要危害8～18周龄的鸡,引起急性小肠球虫病,给养鸡业造成极大的经济损失,因此迫切需要寻找可行的防控措施。鸡球虫的生活史包括孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖三个阶段,其生长发育过程中的一些关键性调控因子可能是防控鸡球虫病的有效作用靶点。在本课题组的前期研究工作中,已应用SMART技术构建了毒害艾美耳球虫子孢子cDNA文库。在此基础上,本研究对该文库进一步筛选,以获取毒害艾美耳球虫的功能基因,并对毒害艾美耳球虫SNF2基因进行克隆表达和免疫原性分析,为研究毒害艾美耳球虫亚单位疫苗奠定基础。首先,用免疫学和质粒文库两种方法对毒害艾美耳球虫子孢子cDNA文库进行筛选,获取EST序列。(1)免疫学方法:用制备的鼠抗子孢子可溶性蛋白多抗作为一抗,对文库进行筛选,初筛得到40个疑似阳性克隆,经两次复筛后获得190个阳性克隆;将复筛得到的阳性噬菌体载体λTriplEx2转化为质粒载体pTriplEx2后,送公司测序,得到26条球虫基因组的EST序列,共5个重叠群。(2)质粒文库方法:直接将λTriplEx2噬菌体文库转化为pTripIEx2文库,选出150个克隆,送公司测序,得到53条EST序列,共21个重叠群。比较两种方法获得的EST序列,有5条序列相同。对21个重叠群的生物信息学分析显示,其分别编码参与DNA复制过程的SNF2家族解旋酶、延伸因子G,参与RNA前体剪接过程的剪切因子,调节蛋白如丝氨酸蛋白酶抑制剂,参与细胞周期调控的PUA结构域蛋白,线粒体内膜tim17亚单位,结构域蛋白如丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、腺苷酸环化酶相关蛋白,子孢子入侵相关的微线体蛋白mic-1、核糖体蛋白、顶体膜抗原、MA2(ma-2)mRNA,Etm033F10 假设蛋白,Etm087F12 假设蛋白,Etm032G09 假设蛋白和Etm128F02假设蛋白。其次,从获得的EST序列中选取毒害艾美耳球虫SNF2基因开展研究。根据GenBank中毒害艾美耳球虫SNF2基因序列设计3对引物,用RT-PCR的方法,通过分段扩增再拼接的方法获得了毒害艾美耳球虫全长SNF2基因序列,并对该基因进行了氨基酸序列、功能结构域等分析研究。该基因全长3 426 bp。接着对SNF2基因N端结构域序列进行截短原核表达,表达的融合蛋白大小为36 kDa左右,主要以包涵体形式存在。用表达产物制备鼠多抗,再以该多抗经Western blot检测子孢子可溶性蛋白,发现天然的SNF2蛋白大小为120 kDa左右,与预测的理论值相符。最后,将纯化复性的重组蛋白rEnSNF2按不同剂量(200、100、50 μg/羽)免疫无球虫感染的雏鸡,免疫2次后,除未免疫未攻虫组外,其余各试验组均感染毒害艾美耳球虫孢子化卵囊,以成活率、卵囊减少率、病变记分、平均增重等为指标,评测重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,rEnSNF2以每羽鸡200μg的免疫剂量保护效果最好,与未免疫未攻虫组相比,重组蛋白rEnSNF2能降低病变记分与卵囊产量,提高存活率,并能诱导机体产生特异性抗体。
【图文】：

性斑的边缘形成明显的深紫色环，而中央部分颜色相对较淡，大部分阳性斑的斑缘外周有逡逑较淡的白色晕环。阴性斑主要特征为白色晕环，个别白色反应斑中央虽有杂交痕迹但显色逡逑较淡（图１－１）。逡逑Ｌ邋ｊ逡逑图１－１毒害艾美耳球虫子抱子ｃＤＮＡ文庠免疫学筛选结果逡逑Ｆｉｇ．１－１邋Ｉｍｍｕｎｏｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｏｆ邋Ｅ．邋ｎｅｃａｔｒｉｘ邋ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ邋ｃＤＮＡ邋ｌｉｂｒａｒｙ逡逑２．２质粒文库方法筛选结果逡逑

逡逑挑取长势较好的单菌落进行ＰＣＲ检测（图１－２），结果显示，质粒文库片段大小集中逡逑在３００－１邋５００ｂｐ之间，与构建文库时的鉴定结果相吻合。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋１逦２逦３逦４逦５逦６逦７逦８逦９逦１０邋１１邋１２邋１３逦１４邋１５邋１６邋１７邋１８逦１９邋２０逦２１逡逑ｆｃｇＷｌｒｉＢｌＩＭＭａｉＢｉｒ１—ＨｌＷｉｉＬ．．邋ｒｙ＾ｒ２逡逑ＵＭｉｉｉｉＢＭＭｉＭｌＩＢＢＩＢＢｌＩＢＢＢＢＢＢＢｌｉＢｉｉ逡逑图１－２阳性克隆ＰＣＲ产物的凝肢电泳结果逡逑Ｆｉｇ．１－２邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃＤＮＡ邋Ｌｉｂｒａｒｙ邋ｃｌｏｎｅｓ逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ标准分子量ＤＬ２邋０００；邋１－２１：阳性克隆ＰＣＲ产物逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ邋２邋０００；邋１－２１：邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｌｏｎｅｓ逡逑２．３获得的ＥＳＴ序列与功能分析逡逑比较免疫学筛选和质粒文库筛选两种方法获得的ＥＳＴ，有５条序列相同的。对２１个逡逑重叠群的生物信息学分析显示，，分别编码参与ＤＮＡ复制过程的ＳＮＦ２家族解旋酶，调节逡逑蛋白如丝氨酸蛋白酶抑制剂，参与细胞周期调控的ＰＵＡ结构域蛋白，线粒体内膜ｔｉｍｌ７逡逑亚单位，结构域蛋白如丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酶，子孢子入侵相关的微线体蛋白、核糖逡逑体蛋白、Ｍｉｃ－１、ＭＡ２邋（ｍａ－２）邋ｍＲＮＡ邋等（表邋１－３）。逡逑表１－３邋ｃＤＮＡ文库测序序列汇总逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－３邋ｔｈｅ邋ｓｕ
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.7

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本文编号：2652313