csal1和csal3基因协同抑制前等级卵泡生长发育的作用

发布时间：2020-05-07 03:33

【摘要】：作为家禽最主要的经济性状之一,产蛋性状(包括产蛋枚数和蛋重等)在不同品种或品系之间存在着显著差异,此差异主要源于鸡的卵泡发育,而其中前等级卵泡的发育影响着优势卵泡选择及产蛋性能,因此,本研究以鸡前等级卵泡为供试材料,深入挖掘影响前等级卵泡发育的因素。有研究表明,婆罗双树基因Spalt(Sall)能够在人类和小鼠的胚胎和生殖器官的发育过程中起到非常重要的调控作用,但其在鸡卵泡生长发育过程的调节作用却未有报道。本研究以海兰褐蛋鸡为实验材料,在对鸡SALL1(csal1)和SALL3(csal3)基因的m RNA和蛋白质在前等级卵泡中的时空表达模式进行分析的基础上,利用PCR-SSCP技术检测csal1和csal3基因在大骨鸡产蛋性状上的遗传效应,并采用过表达、干扰等实验方法,利用荧光定量PCR(RT-q PCR)技术检测分析csal1和csal3基因m RNA的过表达以及小RNA干扰(si RNA)对颗粒细胞中CCND1、Bcat、St AR、CYP11A1和FSHR基因m RNA表达水平的影响;且利用Brd U试剂盒检测颗粒细胞的增殖变化,从而探讨csal1和csal3基因对前等级卵泡颗粒细胞的增殖、分化和卵泡选择的潜在作用及调控机制。主要研究结果如下:1.csal1和csal3基因m RNA在前等级卵泡中的表达模式定性PCR实验结果显示,csal1和csal3基因m RNA在鸡卵巢不同发育阶段的前等级卵泡(直径1-3.9 mm、4-4.9 mm、5-5.9 mm、6-6.9 mm、7-8 mm)中均有表达,提示csal1和csal3基因参与前等级卵泡的生长发育。利用荧光定量PCR检测csal1和csal3基因m RNA在不同发育阶段的前等级卵泡中的表达量,结果显示随着前等级卵泡颗粒细胞的增殖与分化,csal1基因呈现出逐渐上升的趋势,到直径6-6.9 mm的卵泡中的表达量最高;随着前等级卵泡的发育,csal3基因表达亦呈现上升的趋势,到直径7-8 mm的卵泡中的表达量最高,初步揭示两个基因在m RNA水平参与前等级卵泡的发育调控。2.CSAL1和CSAL3蛋白质分子在前等级卵泡中的时空表达模式免疫荧光结果显示,CSAL1和CSAL3蛋白在不同发育阶段的前等级卵泡中的颗粒细胞、卵母细胞、间质以及上皮细胞中均表达;且主要分布在细胞质中,推测CSAL1和CSAL3可能均以核移位的方式参与不同大小前等级卵泡发育的调控作用。3.csal1和csal3基因在大骨鸡产蛋性状上的遗传效应通过PCR-SSCP技术筛选候选基因csal1和csal3的SNP位点,并依据收集的产蛋相关数据来探讨csal1和csal3基因多态性与大骨鸡产蛋性状(蛋重、产蛋量等)的相关性。PCR-SSCP实验并关联产蛋性状的分析结果显示:csal1基因第2外显的SNP位点(729 CA)和csal3基因第2外显的SNP位点(1014 TA),与产蛋性状(蛋重、产蛋量)有相关性,且对应的加性效应百分比相对较高。在四个组合基因型中,TATT基因型与产蛋性状(蛋重、产蛋量)具有较高的相关性。结果表明,在参与卵泡发育的csal1和csal3基因中筛选出的两个与产蛋性状相关的单核苷酸多态性位点,可作为潜在的分子标记为选育高产蛋鸡提供分子生物学理论基础。4.csal1和csal3基因过表达对前等级卵泡生长发育的抑制作用在成功转染空载质粒(阴性对照)与重组的表达载体p Yr-adshuttle-4-csal1和p Yr-adshuttle-4-csal3的颗粒细胞中,CCND1、Bcat、St AR、CYP11A1和FSHR基因m RNA的表达水平均显著下降(P0.05),且颗粒细胞的增殖显著降低(P0.05),说明csal1和csal3基因m RNA过表达对前等级卵泡颗粒细胞的增殖、分化以及卵泡的选择具有抑制的作用,此过程中,过表达csal1基因后,csal3基因m RNA的表达水平显著上调(P0.05),同样,过表达csal3基因后,csal1基因m RNA的表达水平显著上调(P0.05),同时过表达两基因后,上述五个基因的表达水平及颗粒细胞增殖水平明显低于其他各组,据此推测,csal1和csal3基因对前等级卵泡生长发育具有协同调控的作用。5.进一步验证csal1和csal3基因协同抑制前等级卵泡生长发育的作用采用si RNA干扰的方法进一步验证在前等级卵泡中csal1和csal3基因对其生长发育的抑制作用,结果显示,前等级卵泡颗粒细胞的增殖以及细胞中CCND1、Bcat、St AR、CYP11A1和FSHR基因m RNA的表达水平均显著上调(P0.05),证实csal1和csal3基因对前等级卵泡颗粒细胞的增殖、分化和卵泡选择具有抑制作用;此过程中,干扰csal1基因后显著抑制csal3基因m RNA的表达水平(P0.05),同样,干扰csal3基因后显著抑制csal1基因m RNA的表达水平(P0.05),同时干扰两基因后,上述五个基因的表达水平及颗粒细胞增殖水平明显高于其他各组,此结果进一步验证了csal1和csal3基因对前等级卵泡的生长发育发挥着协同调控的作用。本研究显示,csal1和csal3基因m RNA在前等级卵泡的不同发育阶段均有表达,且其蛋白质分子的表达定位在颗粒细胞、卵母细胞、卵巢间质和上皮细胞中;在csal1和csal3基因中筛选出的两个与产蛋性状相关的单核苷酸多态性位点,可作为潜在的分子标记为选育高产蛋鸡提供分子生物学理论基础;过表达和干扰结果表明,csal1和csal3基因对前等级卵泡生长发育的调控是通过协同抑制颗粒细胞的增殖、分化和卵泡的选择来实现的,此为进一步揭示csal1和csal3基因调控前等级卵泡的作用机制提供了分子依据,在募集卵泡、选择优势卵泡和卵泡等级化发育的方面提供了深入研究其遗传机理的理论基础;也为提高鸡产蛋性状的主效基因的挖掘以及进一步开展以提升产蛋性状为育种目标的地方品种改良提供了参考依据,具有重要的科学意义和学术价值。
【图文】：

存在于卵泡（follicle）中，但在成年阶段，，仅有数百个卵母细胞会被选择，最终发育成熟并成功排卵，其中不同等级卵泡数量的动态平衡是通过募集卵泡、优势卵泡的选择等来维持的，这是一个及其复杂的过程[4,8-11]。这数百个可发育成熟的卵母细胞中，包含了成百的小白卵泡（SWF）和大白卵泡（LWF），小黄卵泡（SYF）以及大黄卵泡（LYF）。小白卵泡（直径≤1 mm），大白卵泡（直径 2-5 mm）和小黄卵泡（直径 5-8 mm）被统称为前等级卵泡，而大黄卵泡（直径 9-40 mm）即为排卵前的等级卵泡，只有极少数的前等级卵泡可以进入等级卵泡，它们遵循着一个严格的等级化程序（F1-F6），F1 代表了已经成熟，即将排卵的卵泡，F6则代表等级卵泡中最后成熟排卵的卵泡。这样一个等级化制度保证了每天都会有一个卵泡从小黄卵泡池中被选择进入等级化卵泡池中发育成排卵卵泡[10,12,13]。同样，大白卵泡的募集也是一个持续的过程来保证小黄卵泡池。排卵后不形成黄体，这是禽类与哺乳动物的不同所在，是禽类卵泡发育的独特之处[14]。随着发育的成熟，卵巢的重量也随之增大，在卵巢表面突出着外观如一串葡萄的卵泡，它们是由不同颜色、不同大小的卵泡依靠卵泡柄相连。成熟卵泡内只有其中分布毛细血管的卵泡膜，而没有卵泡液及卵泡腔[4,15]。

csal1基因的定性PCR检测Fig.1.1QualitativePCRdetectionofcsal1gene
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S831.2

【参考文献】

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本文编号：2652368