DDX56抑制Ⅰ型干扰素信号转导及促进口蹄疫病毒复制的研究

发布时间：2020-05-07 03:43

【摘要】：由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的口蹄疫(foot-and-mouth,FMD)是发生于羊、牛、猪等偶蹄动物中的烈性、急性和高度传染性疾病。此病给全球畜牧业造成非常大的损失。天然免疫反应是机体抵御病毒感染的第一道防线,起到清除病原体,保护机体的作用。FMDV感染宿主会引起宿主的天然免疫反应,同时FMDV也会利用宿主自身的蛋白拮抗宿主免疫反应而促进自身的复制。DEAD-box RNA解旋酶(DDX56)主要参与RNA的代谢过程,研究表明其可以促进西尼罗病毒(WNV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)的复制,但其中的机制并不清楚。课题组前期研究发现人源DDX56可以减少仙台病毒(Sendai virus,SeV)引起的IFN-β的生成,并且发现猪源DDX56可以促进FMDV的复制,表明这两者之间有一定的联系。首先为了阐明人源DDX56阻止IFN-β生成的分子机制,过表达实验表明人源DDX56可以明显阻止IFN-β通路的激活和IFNB1基因的转录。而将人源DDX56沉默或缺失后,SeV引起的IFN-β的表达水平明显升高,水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的复制水平明显降低。进一步研究发现病毒感染可以促使人源DDX56与IRF3互作。过表达人源DDX56可以明显减少IRF3的入核。而人源DDX56沉默和敲除后,病毒引起的IRF3的入核增加。另外我们也发现过表达人源DDX56可以阻止IRF3和IPO5的相互作用,而沉默或缺失人源DDX56后,IRF3与IPO5的相互作用明显增强。这些结果表明人源DDX56通过破坏IRF3与IPO5的相互作用来减少IRF3的入核。为了确定人源DDX56的功能位点,我们构建了人源DDX56的突变体,发现人源DDX56的D166位点是其发挥抑制天然免疫反应的关键功能位点。为了探究猪源DDX56在FMDV复制中的作用,我们检测了猪源DDX56对FMDV复制的影响。结果表明过表达猪源DDX56可以明显促进FMDV的复制,而沉默猪源DDX56则使FMDV的复制减少。我们发现猪源DDX56可以阻止病毒引起的IFN-β的活化,并且与IRF3有相互作用。为了进一步探究猪源DDX56促进FMDV复制的分子机制,我们通过报告基因筛选试验发现猪源DDX56可以协同FMDV病毒蛋白VP0,VP1,VP2和3A阻止IFN-β的活化。并且通过免疫共沉淀试验发现猪源DDX56可以与FMDV病毒蛋白VP0,VP1,VP2和3A有相互作用。进一步试验证明,猪源DDX56可以协同FMDV 3A减少磷酸化IRF3的水平,同时猪源DDX56的D166位点是其促进FMDV复制的关键位点。总之,我们发现人源DDX56在病毒感染细胞后能与IRF3相互作用,破坏了IRF3与IPO5复合体的形成而抑制IRF3的入核,从而负调控病毒引起的IFN-β的生成。在随后的研究中,我们发现在FMDV感染期间,猪源DDX56可以协同FMDV 3A减少IRF3的磷酸化而减少IFN-β的生成,最终促进FMDV的复制。我们的研究阐述了病毒诱导的IFN-β产生的部分调控机制,同时阐述了FMDV拮抗宿主天然免疫系统的新机制,深化了我们对宿主天然免疫和FMDV致病机制的认识。
【图文】：

病毒诱导

14图 2.2 沉默 DDX56 显著促进病毒诱导的 IFN-β 的活化（A）DDX56-RNAi 质粒对内源性 DDX56 表达的影响。（B-E）沉默 DDX56 促进 Poly I:C 或 SeV 诱导的 ISRE 和启动子 IFN-β 的激活。将构建的 DDX56-knockdown 的 293T 细胞转染 100 ng IFN-β 或 100 ng ISRE 报告基因质粒。转染 20 h 后，细胞用 SeV 刺激 12 h，或者 Poly I:C (1 μg/ml)刺激 18 h 或不处理，然后进行报告基因检测。（F）沉默 DDX56 增加 SeV 诱导的 TBK1, IRF3 和 IκBα 的磷酸化。将 DDX56-knockdown 的 293T 细胞用 SeV 刺激 0 h，6 h，12 h 或不处理，收取细胞样品用相应的抗体进行免疫印迹分析。（G-K）沉默 DDX56 促进 SeV 诱导的 IFNB1,TNFa, Il8, Rantens 和 Isg56 基因的转录。将 DDX56-knockdown 的 293T 细胞用 SeV 刺激 12 h 或不处理，然后进行 Q-PCR 检测。Fig. 2.2 Knockdown of DDX56 potentiates virus-triggered induction of IFN-β(A) Effects of DDX56-RNAi plasmids on the expression of endogenous DDX56. (B-E) Knockdown of DDX56potentiates SeV- or Poly I:C-triggered activation of the IFN-β promoter and ISRE. The stable DDX56-knockdown 293Tcells were transfected with the IFN-β promoter or ISRE (100 ng). Twenty-four hours after transfection, the cells were leftuninfected or infected with SeV for 12 h or were treated or untreated with Poly I:C (1 μg/ml) for 18 h before reporterassays were performed. (F) Knockdown of DDX56 increases the SeV-induced phosphorylation of TBK1, IRF3 and IκBα.

原件,启动子,相互作用,信号

图 2.4 DDX56 在 IRF3 水平调控 IFN-β 的产生（A-B）DDX56 通过不同的信号原件对 IFN-β 启动子和 ISRE 激活中的作用。将 293T 转染 ISRE 和启动子 IFN-β报告质粒各 100 ng，同时转染 DDX56 表达质粒和 RIG-I (CARD)、MDA5、VISA、TBK1 和 IRF3 表达质粒各 100ng，转染 24 h 后进行报告基因检测。Fig. 2.4 DDX56 mediates virus-triggered signaling at the level of IRF3.(A-B) DDX56 affects the activation of IFN-β promoter and ISRE by various signal components. The 293T cells weretransfected with the IFN-β promoter or ISRE reporter (100 ng), and the expression plasmids for DDX56 and the indicatedproteins (100 ng each). Luciferase assays were performed 24 h after transfection.2.4.5 DDX56 与 IRF3 存在相互作用以上实验已经证明 DDX56 在 IRF3 水平抑制 IFN-β 的产生，，我们接下来验证 DDX56 与 IRF3之间是否发生相互作用。因为 IRF3 与 IRF7 能形成异源二聚体，且 IRF3 与 IRF7 有较高的同源性，因此我们将 DDX56 分别与 IRF3 或 IRF7 共转染，然后进行免疫共沉淀实验。结果表明 DDX56与 IRF3 相互作用而与 IRF7 没有相互作用（图 2.5A）。为了进一步验证 DDX56 与 IRF3 的相互作用，我们进行内源性 CO-IP 实验，发现 DDX56 与内源性 IRF3 能发生互作，并且两者之间的相互作用不依赖于 SeV 的感染（图 2.5 B）。我们又通过免疫荧光实验发现，DDX56 与 IRF3 存在共定
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

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