猪弓形虫感染ELISA和胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立与初步应用

发布时间：2017-03-24 16:09

  本文关键词：猪弓形虫感染ELISA和胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立与初步应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)简称弓形虫是专性细胞内寄生虫。它可引起严重的人畜寄生虫病并呈全球性分布及流行。弓形虫的终末宿主是猫及猫科动物,但是其中间宿主包括的动物种属却较多,其中猪就是其中间宿主之一,并且猪弓形虫的感染率及死亡率也较高。在我国猪弓形虫病的分布地区也较广,猪肉在我国的消费比例较高,已经成为人感染弓形虫的重要来源。这就给养猪业和人类健康造成严重的危害。但目前对弓形虫病还没有特效的治疗药物和有效疫苗。因此,建立一种方便、快捷的猪弓形虫病诊断方法尤为重要。目前用于弓形虫病诊断的方法有很多,如病原学诊断(检测结果确实、可靠,但是耗时、检出率低)、分子生物学诊断(敏感性高,但对仪器、人员要求较高)和免疫学诊断(操作简单、敏感特异、结果判定直观)。本研究应用免疫学诊断方法对弓形虫病进行检测其主要研究内容及结果如下:1.弓形虫SAG3成熟肽基因的克隆、原核表达及鉴定根据Gen Bank AF340227已经发表的弓形虫表面抗原SAG3基因序列设计一对特异性引物,PCR扩增SAG3基因片段。经Eco R?、Hind???双酶切后克隆到原核表达载体p ET-28a中,构建重组表达质粒p ET-28a-SAG3并将其转化至BL21中,经IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE显示p ET-28a-SAG3主要以包涵体的形式存在。Western blotting分析该重组蛋白能被猪弓形虫阳性血清识别,反应原性较好。2.猪弓形虫抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用利用纯化的SAG3蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法,并对反应条件进行优化,优化结果显示:最佳蛋白包被浓度为31.25ng/孔,以5%脱脂奶粉为最佳封闭剂,被检血清稀释度为1:320,酶标二抗最佳工作浓度为1:3000。该方法的灵敏性试验中,血清稀释度在1:6400时仍判为阳性;该方法批内、批间重复的变异系数分别小于3%,12%重复性较好;采用该方法对8份阳性血清进行检测均为阳性,对吉林地区某猪场94份猪的待检血清以及广东地区某猪场54猪血清进行检测,阳性率分别为8.51%(8/94)、46.29%(25/54)。3.猪弓形虫感染双抗夹心ELISA检测方法的建立与初步应用利用实验室已制备的抗弓形虫重组蛋白SAG3单克隆抗体(Anti-A-SAG3-7和Anti-A-SAG3-23)建立双抗夹心ELISA方法并对各个反应条件进行优化。结果显示:Anti-A-SAG3-7作为捕获抗体包被的最佳稀释度为1:3200,猪弓形虫循环抗原(CAg)阳性参照血清的最佳稀释度为1:80,最佳封闭液为1%BSA,HRP-Anti-A-SAG3-23的最佳稀释倍数为1:3200。该方法敏感性达1:640,并且此方法与两份猪囊虫阳性血清无交叉反应,计算批内、批间变异系数均小于11%,表明所建立的双抗夹心ELISA方法具有良好的敏感性、特异性和重复性。检测广东、吉林某地各94份待检血清,结果阳性率分别为20.2%(19/94)、11.7%(11/94)。4.猪弓形虫感染免疫胶体金试纸条的研制及初步应用利用柠檬酸三钠还原法制备40nm粒径的胶体金溶液,标记抗弓形虫重组蛋白SAG3的单克隆抗体(Anti-A-SAG3-7)并对其标记条件进行优化,用另一株抗SAG3的单克隆抗体(Anti-A-SAG3-23)和羊抗小鼠Ig G抗体分别包被硝酸纤维素膜上的检测线(T线)与质控线(C线)。组装试纸条并优化其检测条件。对试纸条的性能进行测试并检测待检样品。结果如下:每毫升胶体金溶液的最适PH值是加入4μl 0.2M/L K2CO3,抗体的最佳标记量为12μg。T线与C线的最佳包被浓度均为0.25mg/m L,最佳包被体积均为0.8μl。该方法的敏感性达1:160;与两份猪囊虫阳性血清无交叉反应;稳定性试验结果表明,试纸条置于4℃和室温分别可保存3个月、1个月有效。分别对广东、吉林地区某猪场各94份猪待检血清进行检测,阳性率分别为18.08%(17/94)、10.63%(10/94)。利用胶体金试纸条与双抗夹心ELISA法做对比检测同一批样品,两者的符合率分别为89.47%,90.90%,两种方法的符合率较高。结果表明,胶体金免疫层析法具有敏感、特异,操作简单等优点。因而,本研究更适用于广大基层单位对时间紧、样品数量大的检测,为猪弓形虫病的早期诊断提供了一种快捷、实用的方法。
【关键词】：刚地弓形虫 SAG3 原核表达 ELISA 胶体金
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-11
• 英文缩略词表11-12
• 前言12-14
• 第一篇 文献综述14-22
• 第一章 弓形虫诊断研究进展14-22
• 1 弓形虫病诊断方法14-22
• 第二篇 研究内容22-66
• 第一章 弓形虫表面抗原SAG3基因的原核表达与鉴定22-35
• 1.1 材料与方法22-30
• 1.2 结果30-33
• 1.3 讨论33-34
• 1.4 小结34-35
• 第二章 弓形虫SAG3蛋白抗体检测ELISA方法的建立与初步应用35-45
• 2.1 材料与方法35-38
• 2.2 结果38-42
• 2.3 讨论42-43
• 2.4 小结43-45
• 第三章 双抗夹心ELISA检测猪弓形虫血清循环抗原方法的建立与初步应用45-52
• 3.1 材料与方法45-47
• 3.2 结果47-50
• 3.3 讨论50-51
• 3.4 小结51-52
• 第四章 猪弓形虫病免疫胶体金快速检测试纸条的研制及初步应用52-66
• 4.1 材料与方法52-58
• 4.2 结果58-64
• 4.3 讨论64-65
• 4.4 小结65-66
• 结论66-67
• 参考文献67-76
• 导师简介76-78
• 作者简介78-79
• 致谢79

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杜夏夏;徐鹏;;弓形虫病免疫学诊断方法的研究进展[J];现代畜牧兽医;2015年02期

2 冷丽;罗米;高菊;申丽洁;;刚地弓形虫速殖子表面抗原的研究及应用[J];中国血吸虫病防治杂志;2014年06期

3 潘严;李彩云;陈啸天;张超;潘学营;;酶联免疫法与间接血凝法检测实验动物家兔弓形虫抗体的结果比较[J];中国医药科学;2014年17期

4 杨亚晓;陈玉昆;魏世锦;宋任浩;;3种方法检测弓形虫IgG抗体的效能[J];中国血吸虫病防治杂志;2014年01期

5 李冕;尹昆;闫歌;;弓形虫病的诊断技术及其研究进展[J];中国病原生物学杂志;2011年12期

6 骆方军;陈建中;;弓形虫B1基因实时荧光定量PCR无创检测方法的建立及临床初步应用[J];中国妇幼保健;2011年28期

7 郭朝刚;;弓形虫病免疫诊断技术研究进展[J];甘肃畜牧兽医;2011年02期

8 房超;张泉;易海华;吴萍兰;徐波;吴亚力;;检测犬瘟热病毒的单克隆抗体胶体金试纸条的制备[J];中国动物传染病学报;2011年02期

9 刘玉;唐雨德;王永山;王平;;应用SPA胶体金试纸条检测囊虫特异抗体[J];实用预防医学;2010年12期

10 何光志;田维毅;钱宁;简昌友;安永如;;胶体金免疫层析法快速诊断犬弓首蛔虫病[J];安徽农业科学;2010年24期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 马亮;弓形虫表面抗原SAG3单克隆抗体的制备及应用研究[D];吉林大学;2012年

2 王妍;弓形虫GRA3基因的原核表达及单克隆抗体的制备与初步应用研究[D];延边大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 张桐嘉;旋毛虫与肝癌H7402相关抗原蛋白的单克隆抗体制备及应用[D];吉林大学;2014年

2 葛巍;弓形虫致密颗粒蛋白GRA7基因的原核表达及牛血清ELISA检测方法的建立[D];吉林农业大学;2014年

3 李超辉;胶体金免疫层析试纸条定量检测猪尿以及猪肉中的克伦特罗残留[D];南昌大学;2014年

4 江海海;江西猪弓形虫病和衣原体病血清学调查及我国部分地区猪弓形虫基因型研究[D];中国农业科学院;2014年

5 彭交凤;日本血吸虫感染血清中循环抗原的筛选与鉴定[D];中南大学;2014年

6 任科研;应用免疫胶体金技术对猪旋毛虫病诊断方法的研究[D];吉林大学;2012年

7 李聪颖;山羊弓形虫病免疫胶体金快速检测试纸条的研制[D];延边大学;2010年

8 许欣;湖羊早期妊娠诊断免疫胶体金层析试纸条的初步研制[D];南京农业大学;2010年

9 段张秀;抗弓形虫单克隆抗体的制备及夹心ELISA方法的建立[D];河南农业大学;2009年

10 朱冠虹;弓形虫SAG1基因原核表达与间接ELISA检测方法的建立[D];扬州大学;2009年

  本文关键词：猪弓形虫感染ELISA和胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立与初步应用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：265838