鸡CEF重编程成为PGC诱导体系的建立及其迁移归巢功能的研究

发布时间：2020-05-15 00:46

【摘要】：19世纪以来的家畜良种化进程使全球性的家畜品种逐渐趋于单一化,大量的遗传资源尤其是地方品种遭到破坏。直至21世纪初,全球已知的7616个家畜品种中已有45%的品种濒临灭绝。在哺乳动物家畜中,体细胞核移植、体外受精和胚胎移植技术均已成功,能够结合精子、卵子、胚胎甚至是体细胞的冻存,实现种质资源的保护和物种复原。由于卵生的特点,上述方法均难以在家禽上实现。家禽的原始生殖细胞(Primordial germ cell,PGC)具有独特的通过血液迁移定居于性腺的特点,使得PGC迁移路径成为实现禽类物种复原的唯一途径。但是单个胚胎所获取的PGC远不足以满足实际应用所需。尤其是濒危品种的PGC来源成为了限制这一技术的难题。而体细胞能够在短期内大量获取,若能将其诱导成PGC无疑是解决这一困难的最佳路径。为了解决鸡体细胞诱导为PGC的难题,本研究对狼山鸡的鸡胚成纤维细胞(Chicken embryonic fibroblast,CEF)通过单细胞克隆技术进行了建系,获得了狼山鸡胚成纤维细胞单克隆细胞系(Chicken embryonic fibroblast single cloned cell line-Langshan,CSC-LS)。在 CEF和CSC-LS中通过慢病毒过表达重编程因子Oct4,Sox2,Nanog和Lin28结合BMP4/BMP8b/EGF诱导体系,将CEF重编程诱导出具有迁移能力的iPGC。以黑羽狼山鸡为供体,隐性白羽鸡为受体,建立了由CEF诱导产生能够迁移PGC的方法。同时,通过制备黑羽狼山鸡与隐性白羽鸡的原代PGC迁移模型产生供体PGC的后代,验证了 PGC路径的可行性,为iPGC的应用奠定了研究基础。研究结果如下:(1)CSC-LS CEF单克隆细胞的建立对狼山鸡CEF进行连续传代培养使之出现凋亡并进入增殖危机,继续培养获得极少数永生化细胞株。永生化细胞株经过单细胞挑取传代培养能够建立CSC-LS单克隆细胞系。对单细胞克隆的培养体系进行优化发现,Ham's F12是制备单细胞克隆的最适培养基,克隆效率为25%±0.01,显著高于DMEM(11%±0.01)和D/F12(12%±0)培养基,口吸管法的单克隆制备效率为32.29%±0.04显著高于有限稀释法的6.95%±0.01。CSC-LS细胞系与正常的CEF相比具有正常的二倍体核型但增殖能力极显著增强(PM.01),增长曲线呈倒S型,细胞周期G2/M期所占比例29.3±0.01极显著高于原代CEF的19.12%±0.01;进一步研究发现CSC-LS无软琼脂克隆能力,原癌基因Ras,c-myc,Src 在 CSC-LS 中的表达量分别为 0.95±1.01,2.70±0.21 和 1.27±0.06 显著低于 DF-1的 0.97±0.99,4.95±0.50 和 11.84±1.27(P0.05),极显著低于 DT40 细胞的 13.49±2.7,19.21±1.23,16.58±1.53(P0.01);CSC-LS提高了脂质体转染质粒载体的转染效率,转染效率为51.3%±0.01极显著高于原代CEF的1.3%±0.003(P0.01)。(2)CEF向iPGC重编程诱导体系的建立成功构建Oct4,Sox2,Nanog,Lin28慢病毒过表达载体。优化慢病毒对CEF和CSC-LS的感染条件,确定5μg/ml聚凝胺,MOI10为最佳感染条件。CEF重编程过程中细胞形态在慢病毒过表达重编程因子后,在第5天时由成纤维的梭状逐渐变圆聚集,形成克隆,第15天时iPS细胞形态逐渐明显,17天后开始形成清晰的克隆集落,能够通过单克隆挑取进行传代培养重新形成细胞克隆,OSNL介导的iPS诱导效率为0.59%±0.03,在此基础上添加VPA后的iPS诱导效率为1.36%±0.24,VPA+VC为1.66%±0.01,均极显著高于仅过表达OSNL的组别(P0.01),初步确定OSNL+VPA+VC为最佳iPS诱导体系并进行后续鉴定。获得的iPSC能够被SSEA-1所标记,碱性磷酸酶所染色,具有二倍体染色体核型。较CEF相比,能够高表达多能性基因Nanog,Oct,Sox2,SSEA-1,CLCD3,Klf4,Rps17,SALL4 差异极显著(P0.01)。Edu 染色发现iPSC有53.30%±0.23的细胞处于增殖状态较饲养层CEF的6.40%±0.05有极显著差异(P0.01)。从感染后第3天至诱导21天对CEF和CSC-LS的内源性多能基因的表达变化检测发现,CEF在重编程过程中能够激活内源多能性基因Oct4,Sox2,Nanog,Lin28和SSEA-1的表达;Oct4,Sox2,Nanog均在第21天的表达量达到最高分别为12.95±1.7,132.1±7.7,22.21±2.3。Lin28 在第 15 天时表达量最高为 25.11±3.08,CSC-LS 不能启动 Sox2,SSEA-1和Oct4的表达。对Oct4,Sox2,Nanog,Lin28的启动子DNA甲基化水平分析发现Oct4,Sox2,Nanog的DNA甲基化水平在诱导过程中持续下降,但Lin28的则无明显变化规律。基于前期建立的ESC向PGC诱导模型进行体外优化实验,结果表明:与BMP4诱导过程相比,BMP8b和EGF能够提高ESC向PGC的诱导效率至26.2%±0.01与BMP4组的7.3%±0.01相比差异极显著(P0.01)。通过相同的体系将iPSC向iPGC诱导,形态学上细胞在诱导2天时开始聚集形成类胚体,4天后开始逐渐聚集增大。iPGC与第二天开始形成诱导效率在第四天达到最高为12.2%±0.01;获得的iPGC能表达Cvh蛋白;通过希夫试剂能够染色标记iPGC中的糖原颗粒;iPGC能够表达PGC的标记基因Cvh,C-kit,Blimp1和部分iPSC的多能性基因Nanog,Sox2,Oct4。将获得的iPGC在2.5天通过鸡胚血管注射至鸡胚,实时观察发现iPGC其能够通过血液迁移至生殖脊,通过冰冻切片能够观察到其绿色荧光,并能够通过蛋白质免疫印迹检测出GFP的表达。整个诱导过程中表观遗传修饰参与调控:组蛋白H3K4me2在CEF向iPGC诱导过程中呈先上升后下降趋势,在iPSC向iPGC诱导第四天时表达量最高后逐渐下降,组蛋白乙酰化水平在CEF向iPSC诱导过程呈上升趋势,iPSC向iPGC诱导过程中在第2天下降后上升。(3)PGC迁移模型的建立将从生殖嵴分离得到的PGC进行无饲养层培养纯化并收集含有大量细胞克隆的PGC;纯化后的PGC中的糖原颗粒能够被希夫试剂染色;表达Cvh和C-kit蛋白;并且高表达的PGC标记基因c-kit,Blimp1,Dazl和Cvh,表达量分别为17.91±0.43,56.26±3.60,14.73±0.23,82.22±2.63 较 CEF 差异极显著(P0.01)。为了验证 PGC与iPGC的迁移能力,通过鸡胚血管注射实验分析四种细胞CEF,ESC,PGC,iPGC的性腺定向迁移能力发现,仅有PGC和iPGC能够通过血管注射迁移至生殖脊。通过2.5天的血管注射试验能够获得含有供体PGC的鸡胚,在18.5天的鸡胚性腺中能够通过冰冻切片检测供体PGC的存在。通过将狼山鸡和隐性白羽的PGC分别注射进对方的鸡胚中均能够形成产生植入PGC的后代,四实验组分别为正常白母鸡×实验黑公鸡,实验黑母鸡×正常白公鸡,实验白母鸡×正常白公鸡,正常白母鸡×实验白公鸡,通过微卫星座位LEI094检测出F2代鸡为狼山鸡后代LEI094长度为290,294,隐性白羽鸡LEI094长度为311,统计各后代产生效率分为12.04%,10.11%,8.96%,8.70%,平均效率为9.95%。
【图文】：

目的与意义逡逑济的不断发展，良种专门化品系的家畜已逐渐不能够满足市场的度来看，少数高产品种所存在的遗传内容是贫乏的。目前人类社会竭的现实，对动物遗传资源保护到了前所未有的关键时刻。对于哺胞核移植克隆技术、体外受精、胚胎移植技术的日益成熟，只要对行保存就可以通过这些技术实现物种复原。但由于家禽卵生的特点。家禽的ＰＧＣ在发育的过程中具有从血液迁移至性腺的特点，使得使ＰＧＣ迁移至性腺发育。这也是在家禽上实现物种复原的唯一途殖嵴一次分离ＰＧＣ的数量为２－５ｘｌ0３，而一次注射至少需要３ｘｌ0３种的ＰＧＣ来源远不能满足实际需求，成为了限制这一技术实现的上进行基因编辑以及转基因仍存在着一定的技术困难。而体细胞能且易于进行转基因及基因编辑操作，若能将其诱导成ＰＧＣ无疑是

２．１邋ＣＥＦ单克隆细胞系ＣＳＣ－ＬＳ的建立逡逑２．１．１细胞形态学观察逡逑原代的ＣＥＦ在通过胰蛋白酶法进行分离培养，原代鸡成纤维细胞呈纺锤状或星型的扁逡逑平状结构，轮廓清晰（图２－２）。逡逑原代ＣＥＦ细胞能够进行传代培养并且能够稳定增殖１０代左右，但经过一定时间的传逡逑代培养后，细胞的增殖能力会下降且开始出现凋亡的现象。在人和小鼠的原代细胞培养过逡逑程中，在传至１０代左右时细胞通常生长出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数的细逡逑胞能够度过危机继续增殖或者传代。本研究发现ＣＥＦ在连续培养的过程中，极少数细胞能逡逑够度过危机并且继续增殖，，最终度过危机形成新的细胞系（图２－３）。逡逑自发永生化产生的细胞系具有较多的杂细胞，通过自制的口吸管可以将单细胞种植在逡逑％孔板中，经过一周的培养可形成可供传代的单克隆集落（图２－４）。通过传代培养可将单克逡逑隆由９６孔板依次传代至４８孔，２４孔，１２孔，６孔直至在６０ｍｍ邋口径的细胞培养皿中培逡逑养，逐渐形成能够持续传代培养的单克隆细胞系ＣＳＣ－ＬＳ（图２－５）。逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S831

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本文编号：2664188