基于肠道微生物测序和灌服原花青素对奶牛酮病的研究

发布时间：2020-05-15 02:17

【摘要】：酮病是高产奶牛泌乳早期高发性营养代谢病之一,对奶牛健康有较大影响。为认识奶牛酮病的发生机制,本研究通过肠道微生物组学手段研究酮病奶牛与健康奶牛的肠道微生物区系的差异性,探讨奶牛酮病发生的原因,并对泌乳早期奶牛灌服葡萄籽提取物原花青素(GSPE),了解它对奶牛酮病相关指标、抗氧化指标等的影响,具体研究内容如下:1.健康奶牛与酮病奶牛肠道微生物区系的差异性分析根据配对设计的原则从某奶牛场产后泌乳早期的奶牛中筛选出酮病组(KET)及其对照组(CON)奶牛各22头,其中KET组由临床酮病组(CK组,n = 3)和亚临床酮病组(SK组,n= 19)组成。在检出酮病当天采集KET组及其CON组奶牛的后肠道粪便,再提取其所有微生物的基因组DNA,通过Illumina HiSeq测序平台利用16S rDNA扩增子测序技术对其进行测序。结果显示:(1)操作分类单位(OTUs)分析与物种注释:获得75724个OTUs,有效数据3739252Tags。GraPhlAn图显示,CK组优势菌群:厚壁菌、放线菌、拟杆菌、变形菌,以及少量的广古菌;SK组优势菌群:厚壁菌、变形菌,但广古菌不在其列;CON组优势菌群:厚壁菌、放线菌、拟杆菌,以及少量的螺旋菌和广古菌。柱形累加图显示,三组在门水平上丰度前十的物种相似,其中厚壁菌与拟杆菌总和均超过80%,在属水平上丰度前十的物种则差异较大,链球菌和lachnoclostridium只在CK组前十,布赫纳氏菌只在SK组前十。(2)组间OTUs共享性分析:三组样品OTUs的韦恩图显示,CK组与CON组共享1967个OTUs,CON组独有696个OTUs,CK组独有35个OTUs;SK组与CON组共享2544个OTUs,SK组独有191个OTUs,CON组独有119个OTUs。CK组与SK组共享1967个OTUs,CK独有35个OTUs,SK组独有768个OTUs。(3)组间比较分析:主坐标分析显示,Unweighted算法得出KET组与CON组奶牛肠道微生物群落差异较大,Weighted算法得出三组样品群落组成结构相似。主成分分析(PCA)显示,三组样品群落组成相似。无度量多维标定法(NMDS)显示,KET组与CON组奶牛肠道微生物有差异。Anosim检验显示,组间差异显著且大于组内差异,CK与CON和SK与CON间差异均显著,CK组与SK组则不显著。置换多因素方差(ADONIS)分析显示,KET组和SK组均与CON组差异显著,而CK组与CON组、CK组和SK组则均不显著,酮病对奶牛肠道微生物有显著影响。T-test检验显示,在门水平上的差异物种,CK组与CON组是酵母菌,SK组与CON组、KET组和CON组都是广古菌,而CK组与SK组则无。在属水平上的差异物种,CK组与CON组是Candidatus_Saccharimonas,Erysipelotrichaceae_UGG-008;SK 组与 CON组是链球菌属(SK组含量极少)、甲烷短杆菌、普雷沃氏菌、Erysipelotrichaceae_UGG-009、毛螺旋菌、Parabacteroides和奇异菌,KET组和CON组是瘤胃球菌属、甲烷短杆菌属、Erysipelotrichaceae_UGG-009、毛螺旋菌属和奇异菌属,CK组与SK组则无;在种水平上的差异物种,SK组与CON组是丁酸梭菌,SK组与CON组、SK组与CK组、KET组与CON组均无。LefSe分析显示,SK组的核心菌群是变形菌、布赫纳氏菌和肠杆菌;CK组核心菌群是γ-变形菌和肠杆菌;CK组的活泼瘤胃球菌含量高于SK组的。SK组的梭状芽胞杆菌和Christensenellaceae则比CK组的高,但差异不显著。2.饲喂GSPE对奶牛血浆和乳汁酮病相关指标、抗氧化指标等的影响将符合入选条件的48头泌乳早期荷斯坦奶牛按完全随机区组设计原则分成四组:对照组(GO)和三个试验组(G20、G40和G80),每组12头奶牛。给各组奶牛分别灌服0、20、40和80mg GSPE/kg BW/day,于第0(灌服前)、10、20、30、40和50d统计产奶量(MY),第0(灌服前)、7、14、21、28、35和42d采集奶样和血样,检测分析以下酮病相关等指标:酮体(KB)、游离脂肪酸(NEFA)、血糖(GLU)、总抗氧化能力(TAC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)、ALT、AST、GGT、TP、ALB、GLOB、BUN、UA、胆固醇、乳蛋白(MP)、非脂乳固体(SNF)、乳脂(MF)、体细胞计数(SCC)。结果显示,三个试验组血浆KB、NEFA和GLU水平与CON组没有显著差异,但KB在时间上存在极显著差异,KB与泌乳天数(DIM)交互有极显著差异(P = 0.0003)。GSH-Px、SOD、TAC和MDA均与试验时间极显著相关(P0.0001),G20的MDA含量在14d时与G0相比显著增加(P=0.0371)。实验组的 ALT、AST、ALB、GLOB 和 TP 和 BUN 和 UA,以及GPX、SOD、TAC和H2O2水平与对照组的水平之间未见显著差异。3.饲喂GSPE对奶牛的安全性研究将符合入选条件的16头泌乳早期荷斯坦奶牛按完全随机设计原则分成四组:对照组(g0组)和三个试验组(g20、g40和g80),各组奶牛分别灌服 0、20、40和 80 毫克 GSPE 每千克体重(BW)每天(mg GSPE/kg BW/day),每24h灌服1次,持续168h。于第0(灌服前)、3、6、12、24、48、72、96、120、144和168h采血检测和分析以下指标:丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、球蛋白(GLOB)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)。结果显示,g20 组在 120h 时,其 ALB(P=0.0361)和 BUN(P=0.0478)显著高于对照组,而g40、g80组的BUN均与对照组无显著差异。g20、g40和g80组与对照组在ALT、AST、GGT、GLOB、TP和UA上均无显著差异。结论:(1)酮病对后肠道微生物区系影响显著,CK与CON的差异物种在门水平上是广古菌门,在属水平上是瘤胃球菌属、甲烷短杆菌属、Erysipelotrichaceae_UGG-009属、毛螺旋菌属和奇异菌属;(2)与CON奶牛相比,SK奶牛后肠道广古菌门细菌显著减少,甲烷短杆菌属尤为明显。后肠道的链球菌属、甲烷短杆菌属、普雷沃氏菌属、Erysipelotrichaceae_UGG-009属、Parabacteroides属和奇异菌属的显著减少,毛螺旋菌属和丁酸梭菌种的显著升高是奶牛亚临床酮病的特征;(3)饲喂GSPE对泌乳早期奶牛血浆KB、NEFA和GLU水平与CON组没有显著差异,但KB在时间上存在极显著差异,KB与泌乳天数交互有极显著差异,(P = 0.0003);(4)给奶牛饲喂GSPE在氧化抗氧化方面,GSH-Px、SOD、TAC和MDA均与试验时间极显著相关(P0.0001),MDA而在处理组与试验时间交互上存在存在显著差异(P = 0.0463)。因暂无法肯定GSPE对酮病治疗有明显的积极作用,有待今后作更深入研究再决定是否推荐使用该产品。
【图文】：

变化情况图,产奶量,平均数,试验期

产奶量（ＭＹ）在统计学上与初始产奶量（ＭＹ－０）极显著相关（估计值＝０．０２５４，邋Ｐ＜逡逑０．０００１），同时还与试验时间极显著相关（Ｐ＜邋０．０００１）。而在处理组与试验时间交互上逡逑存在极显著的影响（Ｐ邋＝邋０．００２５），，其标准最小二乘图如图３－２所示。逡逑３．６逡逑：。逡逑２邋３．２逦Ｇ４０逡逑３．．逦一８。逡逑０逦１０逦２０逦３０逦４０逦５０逡逑Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｔｉｍｅ，邋ｄ逡逑图３－２试验期间产奶量（ＭＹ）的最小：乘平均数变化情况逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２邋Ｌｅａｓｔ邋ｓｑｕａｒｅ邋ｍｅａｎｓ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｍｉｌｋ邋ｙｉｅｌｄ邋ｄｕｒｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｐｅｒｉｏｄ逡逑ＧＯ、Ｇ２０、Ｇ４０和Ｇ８０分别表示饲喂０、２０、４０和８０ｍｇＧＳＰＥ／ｋｇｏｆｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ的组。逡逑５逡逑

变化情况图,最小二乘,乳蛋白,试验期

Ｐ邋＝邋０．０３３６）显著相关。同时还与试验时间极显著相关（Ｐ＜邋０．０００９），与处理组显著相逡逑关（Ｐ＝０．００２１）。而在处理组与试验时间交互上存在极显著的影响（尸＝０．００２３），其逡逑标准最小二乘图如图３－３所不。逡逑１．３８逡逑．１２８邋１逡逑ｆＬ１８邋Ｔ邋一。逡逑０．９８逦ｆ逡逑０．８８逡逑０逦７逦１４逦２１逦２８逦３５逦４２逡逑Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｔｉｍｅ，邋ｄ逡逑图３－３试验期间乳蛋白（ＭＰ）的最小二乘平均数变化情况逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－３邋Ｌｅａｓｔ邋ｓｑｕａｒｅ邋ｍｅａｎｓ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｍｉｌｋ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｄｕｒｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｐｅｒｉｏｄ逡逑ＧＯ、Ｇ２０、Ｇ４０和Ｇ８０分R%表示饲喂０、２０、４０和８０ｍｇＧＳＰＥ／ｋｇｏｆｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ的组。逡逑ｓ逡逑
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.23

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