小鼠卵母细胞中周期蛋白B1的mRNA存储与释放的初步研究

发布时间：2017-03-25 05:02

  本文关键词：小鼠卵母细胞中周期蛋白B1的mRNA存储与释放的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：处理小体(P小体)是一种存在于真核细胞质的蛋白颗粒,它由多种酶组成并参与mRNA调控。卵母细胞的成熟是一个持续时间长且复杂的过程。小鼠卵母细胞的成熟过程存在转录静默的现象,即小鼠卵母细胞从GV期到二细胞期小鼠卵母细胞不进行任何转录活动。然而,小鼠卵母细胞成熟过程需要大量蛋白的参与。不同基因序列,在正确时间的表达是必不可少的。成熟过程中新合成的蛋白只来源于母源mRNA为模板翻译形成的产物。因此,小鼠卵母细胞对母源mRNA的精确调控在小鼠卵母细胞成熟进程中显得尤为重要。淋巴转移蛋白51(MLN51)是一种通过与外显子连接复合体(EJC)偶联而参与mRNA调控的蛋白。最新的研究报道称MLN51定位于P小体中,且过量表达MLN51会导致P小体分解从而导致其包涵的mRNA释放到细胞质中。这里我们对P小体和应激颗粒的主要类型结构进行综述,并着重讨论小鼠卵母细胞内存在的一种P小体类似颗粒在小鼠卵母细胞成熟过程中调控mRNA的作用,提出了P小体类似颗粒在小鼠卵母细胞成熟调控中发挥作用的可能机制。周期蛋白B1(CyclinB1)是参与有丝分裂和减数分裂的一种调节蛋白。。在小鼠卵母细胞减数分裂中期CyclinB1蛋白大量表达,其与MPF的活性亚基CDK1结合,从而促进卵母细胞进入减数分裂的后期,之后CyclinB1被降解,在减数分裂的后期,其含量几乎为零。由于CyclinB1在卵母细胞成熟过程中存在两个峰值,故对其mRNA探究有着较为重要的意义。在此基础上,我们构建了不同功能的CyclinB1变体,这些变体的mRNA能否通过mRNA监控机制从而重新进入P小体有待进一步正式,对这些变体的mRNA在小鼠卵母细胞内代谢调控的研究有一定的意义。本试验以小鼠的P19细胞为材料,利用荧光原位杂交的方法,探求了CyclinB1的mRNA在P19细胞中的地位。然后以小鼠卵母细胞为材料,对小鼠MLN51、CyclinB1全长分子及其变体在小鼠卵母细胞成熟中所起的作用进行了探讨。首先,我们成功克隆小鼠全长型的MLN51基因以及CyclinB1基因并构建了真核表达载体pVenus-MLN51以及pVenus-CyclinB1,并在pVenus-CyclinB1的基础上构建了CyclinB1变体的真核表达载体pVenus-D90-CyclinB1、pVenus-Y167a-CyclinB1和pVenus-D90-Y167a-CyclinB1。所有真核表达载体转染Hela细胞均能够正常表达。本研究利用武汉博士德生物公司的CyclinB1原位杂交检测试剂盒,成功对小鼠P19细胞中的CycinB1的mRNA进行染色,并用荧光显微镜观察到CyclinB1的mRNA在细胞胞浆着色红色。将小鼠pVenus-MLN51、pVenus-CyclinB1以及CyclinB1变体的真核表达载体进行体外转录,将得到的cRNA通过显微注射的方法注射入培养了1小时的牛卵母细胞内,通过荧光显微镜观察到其定位,并且统计卵母细胞生发泡破裂率和第一极体排出率。
【关键词】：周期蛋白B1 P小体 母源mRNA 小鼠 卵母细胞成熟
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S814
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 文献综述12-27
• 第一章 P小体及其结构与功能12-18
• 1.1 P小体的结构14
• 1.2 P小体的主要功能14-15
• 1.3 P小体与应激颗粒的关联15-16
• 1.4 MLN51促进小体分解16-18
• 第二章 卵母细胞的成熟过程及卵母细胞中mRNA存储颗粒18-27
• 2.1 P小体类似颗粒在卵母细胞中对特定的mRNA调控20-23
• 2.2 小鼠卵母细胞mRNA颗粒的猜想23-24
• 2.3 小鼠卵母细胞，对于母源mRNA的再利用存在两种形式24-27
• 试验研究27-46
• 第三章 小鼠 MLN51、Cyclin B1 基因的克隆和真核表达载体的构建以及 FISH27-41
• 3.1 材料和方法27-32
• 3.1.1 实验试剂27-28
• 3.1.2 实验材料28
• 3.1.3 MLN51，CyclinB1及其变体的基因克隆和真核表达载体的构建28-31
• 3.1.4 小鼠P19细胞CyclinB1的mRNA荧光原位杂交31-32
• 3.2 结果32-38
• 3.2.1 小鼠肝脏组织中MLN51 CDS全长克隆及双酶切鉴定32-33
• 3.2.2 小鼠卵巢组织中CyclinB1 CDS和CyclinB1变体的克隆以及双酶切鉴定33-36
• 3.2.3 荧光显微镜下观察重组质粒pVenus-MLN51在Hela细胞中的表达、定位36-38
• 3.2.4 荧光显微镜下观察重组质粒pVenus-CyclinB1及其变体质粒在Hela细胞中的表达、定位38
• 3.2.5 小鼠P19细胞中CyclinB1的mRNA的定位38
• 3.3 讨论38-39
• 3.4 小结39-41
• 第四章 MLN51、CyclinB1及其变体在小鼠卵母细胞中的 作用的初步研究41-46
• 4.1 材料和方法41-44
• 4.1.1 主要试剂41
• 4.1.2 试验材料41
• 4.1.3 在成熟的小鼠卵母细胞中表达MLN51和CyclinB1基因41-44
• 4.2 结果44-45
• 4.2.1 外源MLN51蛋白在小鼠卵母细胞中的定位44
• 4.2.2 CyclinB1及其变体在成熟小鼠卵母细胞中的表达定位44
• 4.2.3 在显微注射MLN51和CyclinB1 cRNA后小鼠卵母细胞体外成熟率的变化44-45
• 4.3 讨论45
• 4.4 小结45-46
• 结论46-47
• 本研究的创新点与进一步研究的课题47-48
• 参考文献48-55
• 致谢55-56
• 作者简介56

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