屎肠球菌噬菌体IME-EFm5的分离鉴定及其裂解酶关键作用位点的研究

发布时间：2017-03-25 02:00

  本文关键词：屎肠球菌噬菌体IME-EFm5的分离鉴定及其裂解酶关键作用位点的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：屎肠球菌(Enterococcus faecium)是一种革兰氏阳性条件致病菌。当机体免疫力低下时,可能会引起多种局部或全身的感染性疾病。烈性噬菌体(Lytic bacteriophage)是一种可以特异性感染和杀死宿主菌的病毒。噬菌体裂解酶(Lysin)是感染后期由噬菌体基因组编码的一种可以水解细胞壁的蛋白酶。噬菌体及其裂解酶可以特异、高效地裂解细菌。由于耐药菌株的广泛出现和新型抗菌药物的缺乏,噬菌体及其裂解酶成为了一个研究热点。本实验对屎肠球菌噬菌体及其裂解酶进行了系统研究。首先,从医院的污水中分离得到了23株屎肠球菌,药敏实验显示,其中9株为万古霉素抗性菌株。然后,以一株万古霉素抗性屎肠球菌4P-SA为受体菌株,分离得到了一株新型屎肠球菌噬菌体,命名为IME-EFm5。对其生物学特性进行研究,该噬菌体属于有尾病毒目、长尾病毒科,头部呈二十面体,直径约为50nm,尾部较长,约为165nm;最佳感染复数为0.01,噬菌体滴度可达到109 PFU/m L;一步生长曲线显示,其潜伏期约为30min,裂解周期约为70min;IME-EFm5对乙醚和氯仿不敏感;在温度为40℃、50℃和p H值为6.0~9.0的环境中活性基本稳定;点滴法和双层平板法都显示,IME-EFm5仅对其宿主菌4P-SA起裂解作用,因而,该噬菌体具有高度的宿主保守性;由SDS-PAGE结果可知,结构蛋白种类多,最主要的结构蛋白大小约为36k Da。对噬菌体IME-EFm5的全基因组进行测序与分析,可知该噬菌体的遗传物质为双链DNA,大小为42,265bp,含有70个开放阅读框(ORFs),G+C%为35.51 mol%。通过同源蛋白数据比对分析,该噬菌体的全基因组序列仅与屎肠球菌噬菌体IME-EFm1的基因组具有较高的相似性。对该噬菌体裂解酶Lys EFm5深入研究表明:Lys EFm5表现出了高效的杀菌活性,可以裂解19株屎肠球菌,包括7株万古霉素抗性菌株,裂解谱远远高于噬菌体本身。因而,Lys EFm5具有治疗耐药性屎肠球菌感染的潜力。同源蛋白的比对分析可知,Lys EFm5的N端可能是amidase家族中的一员。尽管序列差异较大,但是Lys EFm5 amidase片段与金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶Lys GH15的amidase-2片段的3D结构具有很高的同源性。突变蛋白构建后,通过圆二色谱法对Lys EFm5和突变蛋白的二级结构进行检测,结果表明,单个位点氨基酸突变为丙氨酸不影响蛋白的二级结构。酶谱实验和ICP-AES检测结果表明:突变蛋白的活性全部丧失;H27,H132和C140三个氨基酸为Zn2+结合位点;E90和T138为催化活性位点。EDTA处理后,Lys EFm5的活性不受影响,ICP-AES只能检测到微量的Zn2+存在。因而,Lys EFm5不同于其它amidase家族成员,为Zn2+非依赖性水解酶,揭示了一个独特的催化机制。本论文通过对Lys EFm5特性的研究,有力地推进了人们对噬菌体裂解酶amidase片段分子作用机制的认识。
【关键词】：屎肠球菌 噬菌体裂解酶 酰胺酶 Zn2+非依赖性
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 前言12-14
• 第一篇 文献综述14-24
• 第一章 噬菌体作为治疗应用的研究进展14-19
• 1.1 噬菌体概述14-15
• 1.2 噬菌体的应用要求15
• 1.3 噬菌体治疗的限制与缺点15-16
• 1.4 噬菌体的“鸡尾酒”疗法16-17
• 1.5 噬菌体与抗生素的联合应用17
• 1.6 噬菌体制剂的应用研究17-19
• 第二章 噬菌体裂解酶的研究进展19-24
• 2.1 裂解酶概述19-20
• 2.2 裂解酶结构20
• 2.3 裂解酶的应用特性20-21
• 2.4 裂解酶的协同作用21
• 2.5 嵌合裂解酶的应用研究21-22
• 2.6 裂解酶的应用22-24
• 第二篇 研究内容24-70
• 第一章 屎肠球菌及其噬菌体的分离与鉴定24-42
• 1.1 材料24-26
• 1.2 方法26-30
• 1.3 结果30-40
• 1.4 讨论40-41
• 1.5 小结41-42
• 第二章 噬菌体IME-EFm5全基因组测序与分析42-53
• 2.1 材料42-43
• 2.2 方法43-44
• 2.3 结果44-51
• 2.4 讨论51-52
• 2.5 小结52-53
• 第三章 裂解酶LysEFm5的原核表达与活性测定53-61
• 3.1 材料53-54
• 3.2 方法54-56
• 3.3 结果56-60
• 3.4 讨论60
• 3.5 小结60-61
• 第四章 裂解酶LysEFm5关键作用位点的研究61-70
• 4.1 材料61-62
• 4.2 方法62-63
• 4.3 结果63-68
• 4.4 讨论68-69
• 4.5 小结69-70
• 结论70-71
• 参考文献71-80
• 导师简介80-81
• 作者简介81-82
• 攻读硕士期间发表论文82-83
• 致谢83

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